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细胞转染技术PPT一：转染的简介二：转染的分类三：转染的方法一、转染的简介1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。转染的DNA：cDNA,基因组DNA，有目的基因的质粒DNA。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。不表达表达；表达不表达二、转染的分类基因转染真核细胞的方法转染方法化学转染法物理转染法病毒感染法DEAE一葡聚糖法显微注射法逆转录病毒磷酸钙法电穿孔法腺病毒人工脂质体法基因枪法是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时转染，但用于稳定转染却不可靠。DEAE-葡聚糖法

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静磷酸钙共沉淀转染法由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究。原理是，先将外源性DNA和氯化钙混合，然后加入到含磷酸离子的缓冲液，在特定PH下（通常PH7.1），慢慢形成DNA-磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞中，培养一段时间后，通过胞膜的内吞作用摄入DNA。脂质体介导法（目前应用最广泛）原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。【主要应用】:瞬时转染稳定转染.【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)（1）电穿孔法利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。(2）显微注射法该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。（3）基因枪法该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。实验室用到的转染方法脂质体介导法细胞转染以Lipofectamine2000转染试剂为例：转染前一天，将细胞铺到6孔培养板中，加入有血清无双抗的培养基（2ml）；24小时换上无血清无双抗的培养基2ml；将2μg的质粒用375μL无血清无双抗的培养基稀释；取12μL的Lipofectamine2000加入375μL无血清无双抗的培养基稀释；将质粒和Lipofectamine2000稀释液混合在一起，室温放置15-45min后加入培养皿中，再加入750μL无血清无双抗培养基混匀；（注：为一孔的试剂配制量）4-6h后换上完全培养基48h培养观察；注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；脂质体转染法的步骤：转染后筛选筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上所带的真核筛选抗性基因有关的。标有neo（实际上应该是neoresistance）的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因细胞的阳性筛选。标有amp（实际上应该是ampresistance）的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（β－内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏感菌有作用。用于克隆菌的筛选。最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo，所以筛选的时候用G418。G418是目前获得稳转最常用的试剂之一。G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养