SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量.pptVIP

SDS电泳法测定蛋白质分子量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法和测定蛋白质分子量的技术实验原理1、蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。2、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr=－b·mR+K（式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b和K均为常数。）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。实验试剂（1）标准蛋白质（低分子量Marker）蛋白质名称分子量兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸肝酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌酶14400待测蛋白质：牛血清白蛋白、人血清蛋白、γ-球蛋白（2）凝胶试剂1）30%（W/V）丙烯酰胺30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，储于4℃暗处，一个月内可使用。2）1mol/L，pH8.8Tris-HCl缓冲液Tris21g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.8蒸馏水定容1000ml。3）1mol/L，pH6.8Tris-HCl缓冲液Tris21g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH6.8定容1000ml。4）10%（W/V）SDS5）10%（W/V）过硫酸铵（现用现配）6）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)（3）10×电极缓冲液（pH8.3）Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml。使用时10倍稀释。（4）2?样品稀释液SDS500mg，巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，1mol/L，pH6.8Tris-HCl2ml，用蒸馏水定容至10ml。按每份0.5-1.0ml分装，-20℃贮存。以此液制备样品时，样品若为固体，应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入于样品等体积的原液混合即可。（5）染色液（6）脱色液10%（体积分数）甲醇10%（体积分数）冰醋酸脱色需3~10h，其间更换多次脱色液至背景清楚。0.1%（质量分数）考马斯亮蓝R25040%（体积分数）甲醇10%（体积分数）冰醋酸染色1~2h或过夜。实验器材玻璃板，梳子电泳槽，电泳仪实验步骤1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。A液（分离胶缓冲液）4.5mlC液（交联剂）7.5mlH2O（ml）5.9mlD液（10%过硫酸铵）100μlTEMED（μl）30μl2.制备分离胶：(18ml)从冰箱中取出制胶试剂，应平衡至室温。按下表现配制所需浓度的分离胶。配制12.5%分离胶3.制备浓缩胶：(7.55ml)B液（浓缩胶缓冲液）2.0mlC液（交联剂）1.0mlH2O4.5mlD液（10%过硫酸铵）60μlTEMED20μl配制3%浓缩胶4.凝胶液的灌注和聚合用移液枪将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加满蒸馏水。一小时后，待分离胶凝固，倒出蒸馏水，用滤纸吸干，加浓缩胶，将梳子插入胶液顶部。5.加样：用移液枪依次在各个样品槽加样。