小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定.pdfVIP

小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定

[摘要]目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。方法

分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血

清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE

染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表

达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的

形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓

93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚

酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。。结论小鼠三个不同部位均

可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。

巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性

作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解

和提呈抗原等。它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、

NK细胞和T细胞等。小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也

是临床免疫学实验常用的方法之一。现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分

离小鼠巨噬细胞，并做以对比。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清

（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。

1.2从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体

石蜡。待3~4d后收集腹腔细胞。

（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹

腔，用绵球轻揉腹部1~2min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，

用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。

（3）1000rpm离心5min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细

胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中。

（4）如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2×105个/mL，接种到96孔板中，每孔100~200

μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2×106个/mL，加到24孔平底培养板中，1mL/

孔；5%CO2温箱孵育2h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1~2次，弃去未粘附细胞，

贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

1.3从小鼠脾脏中分离巨噬细胞（1）用外科方法无菌摘取小鼠脾脏，置于盛有预冷

RPMI-1640培养基（含1%小牛血清）的平皿中，减去多余的结缔组织和脂肪组织。用无菌

注射器芯将脾脏挤压通过200目的过滤筛，获得单个细胞。

（2）以200g离心10分钟后去上清。用含有1%小牛血清的RPMI-1640培养基将细胞配成

2~3×108/mL。

1.4从小鼠骨髓中分离巨噬细胞（1）颈椎脱臼处死小鼠，取出完整股骨。

（2）用剪刀剪去股骨两端，用注射器吸取PBS，冲洗骨髓细胞至50mL离心管中。

（3）利用40~100µm的细胞滤器对细胞进行过滤后，1200rpm离心5min后去上清，然后用

适量的RPMI1640培养基重悬细胞。

（4）同1.2中方法，台盼兰染色计数，根据不同目的调整细胞浓度，用含有10ng/mLM-CSF

的RPMI1640培养基把细胞接种于培养皿中。37℃，5%CO2培养6~8d，几乎所有贴壁细胞

均为能表达F4/80或CD11b，分化为成熟的巨噬细胞。

1.5巨噬细胞的鉴定

1.5.1活细胞形态观察细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况。

1.5.2HE染色将培养的巨噬细胞经PBS冲洗后，甲醛固定后，采用常规HE染色，中性树

胶封片。

1.5.3细胞吞噬功能检测[4]将培养的巨噬细胞进行鸡红细胞吞噬试验。即在培养体系中加

入鸡红细胞悬液0.1mL，培养箱中孵育1~3.5h，取出血盖片，用等渗液洗去浮在上面