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不同载体-宿主菌组合对重组蛋白表达量的影响

杨刚刚;王泽;白海静;杨亚娟;徐存拴

【摘要】争论了不同载体-宿主菌组合对毕赤酵母重组蛋白表达量的影响。以豹蛙抗瘤酶〔onconase，ONC〕、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、人血清白蛋白〔humanserumalbumin，HSA〕与ONC的融合蛋白即HSA-〔Gly4Ser1〕3-ONC〔简称HSA-ONC〕等5种重组蛋白为报告蛋白，设计并合成了5种基因。分别插入3种酵母表达载体pPIC9、pPIC9K和pPICZα-A中，转化3种毕赤酵母受体菌X-33、GS115和SMD1168。筛选得到7种载体-宿主菌组合，在摇瓶规模进展诱导并定量。争论结果说明：5种外源蛋白在pPICZα-A／X-33组合中表达量最

高，在pPIC9／SMD1168组合中最低。从重组蛋白表达量来说，pPICZα-A／X-33组合优于其他6种载体-宿主菌组合。

【期刊名称】《河南科技大学学报〔自然科学版〕》

【年(卷),期】2023(037)002

【总页数】5页(P78-81,87)

【关键词】载体;宿主菌;载体-宿主菌组合;重组蛋白;表达量

【作者】杨刚刚;王泽;白海静;杨亚娟;徐存拴

【作者单位】河南师范大学生命科学学院，河南乡453007;河南省-科技部共建细胞分化国家重点试验室培育基地和河南省生物工程重点试验室，河南乡453007;河南乡华星药厂，河南乡453007;河南师范大学生命科学学院，河南乡453007;河南省-科技部共建细胞分化国家重点试验室培育基地和河南省生物工程重点试验室，河南乡453007;河南师范大学生命科学学院，河南乡

453007;河南省-科技部共建细胞分化国家重点试验室培育基地和河南省生物工程

重点试验室，河南乡453007;河南师范大学生命科学学院，河南乡453007;河南省-科技部共建细胞分化国家重点试验室培育基地和河南省生物工程重点试验室，河南乡453007

【正文语种】中文

【中图分类】Q815

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)系统是近30年来表现优秀、应用广泛的表达系统

之一[1-4]，目前，已有1000余种重组蛋白在该表达系统中成功得到表达[5]。随着酵母基因组测序工作的完成，该系统已进展成为抱负的重组蛋白表达系统[6]。现有毕赤酵母宿主都是由原始菌株巴氏毕赤酵母NRRLY-11430衍变而来的[7]，主要有3种类型：野生型(X-33)[8]、组氨酸缺陷型(GS115、KM71和MC100-3)以及SMD系列蛋白酶缺陷型(SMD1163、SMD1165和SMD1168)。毕赤酵母表达载体与酵母基因组整合后可稳定遗传[9-10]，常见的表达载体分为两种：胞内表达载体和分泌型表达载体。常见的胞内表达载体有pPICZ、pGAPZ、pHIL-2、

pPIC3K和PAO815，胞内载体表达的蛋白无法运输至胞外，不利于后期表达纯化。常见的分泌型表达载体包括pPIC9(原核氨苄青霉素抗性，真核无抗性)、

pPIC9K(原核卡那霉素抗性，真核G418抗性)和pPICZα系列(原核和真核均为Zeocin抗性)[11]。

重组蛋白的表达量受基因自身性质、表达载体、宿主菌以及培育条件等多种因素的影响[12-13]。本文从载体与宿主菌角度考察多种重组蛋白在毕赤酵母中的表达状况，包括rIL-1α、rIL-1β、rIL-1Ra、rONC和rHSA-ONC等。将含有柔性连接肽(Gly4Ser1)3的HSA-ONC融合基因构建至3类常见分泌型表达载体(pPIC9、

pPIC9K和pPICZα-A)，分别转化至3种酵母宿主(X-33、GS115和SMD1168)，

考察不同载体-宿主组合对重组蛋白表达量的影响。

菌株、质粒和基因。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株购自武汉晶赛生物工程技术；分泌型酵母表达载体(pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A)以及毕赤酵母(X-33、GS115、SMD1168)菌株均购自Invitrogen公司；豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)基因托付上海捷瑞生物工程合成；白细胞介素IL-1(α、β、Ra)和人血清白蛋白-豹蛙抗瘤酶(HSA-ONC)融合基因托付上海生工生物工程合成。

试剂和工具酶。质粒快速提取试剂盒购自北京鼎国生物技术；酵母基因组快速提取试剂盒购自北京博迈德科技进展；限制性内切酶PmeI、BamHI、EcoRI、SacI购自MBI公司；ProteinLadder购自上海赛默飞