冰冻切片实验步骤.docx

冰冻切片试验步骤

全部试验步骤

取颖组织于4%多聚甲醛固定24小时

30%蔗糖脱水48小时以上

-250C包埋〔冰冻切片机内〕

冰冻切片冰冻切片步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤：

冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消退内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)

你确定你是冰冻切片吗冰冻切片不能用热修复啊以下是我的步骤：

1冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。25~10％正常山羊血清〔PBS稀释〕封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

显色剂显色〔DAB〕。

自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O21ml，混匀后使用，每次颖配制。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。

下接免疫组化染色操作步骤。

免疫组化染色步骤：〔SP试剂盒为例)

冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。

5~10％正常山羊血清〔PBS稀释〕封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的生物素标记二抗〔1%BSA-PBS稀释〕，37℃孵育10~30分钟；或滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素〔PBS稀释〕，37℃孵育10~30分钟；或其次代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

显色剂显色〔DAB或AEC〕。

自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，

PBS〔PH为7.2-7.4〕在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min

〔第一次冲洗时间短些，约1min后更换〕

用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份〔需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿〕30min。

PBS〔PH为7.2-7.4，酸性〕在9cm皿内摇床冲洗3次，每次

5min〔第一次冲洗时间短

些，约1min后更换〕，甩去PBS，擦干切片四周的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织四周画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。

5.5%BSA，室温孵育20min，期间留意观看，以免BSA枯燥而导致背景太高，请留意在皿内

玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。

甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓

度不均。

配置一抗工作液用5%BSA〔抗体浓度为1:100〕，悬空参加一抗工作液50-100ul，枪头不

要触及组织，以免损伤组织构造，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。

放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜〔最长不行超过48h〕，留意盖盖，放入后观看玻片是

否处于水平位〔否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，消灭背景高和假阳性〕，孵育期间观看抗体是否干，假设干了赶快用PBS清洗浸泡。

其次天上午取出玻片，置常温复温 30min，后 PBS冲洗1+5+5+5min，

滴加1:100生物素标记的二抗〔留意选择核对一抗来源，抗体参加稀释后在EP管内弹

匀，掌上离心机离心〕室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5mi