分子生物学的酶学基础.ppt

第三节?DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ6、应用2)3’-粘端的末端标记先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下，使3’-端的外切反应与dNTP的搀人反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端带标记的DNA，但是此反应用T4或T7DNA聚合酶效果会更好。5’3’5’3’裂解变性显影第三节?DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ6、应用3)合成cDNA的第二链用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性。但由于具有5→3外切活性，现在已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶cDNA5’3’5’3’第三节?DNA聚合酶二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApolⅡ。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。第三节?DNA聚合酶二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)该酶的催化特性如下：(1)聚合作用:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但是用单链结合蛋白(SBP)可以提高其聚合速率，可达原来的50-100倍。第三节?DNA聚合酶二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)该酶的催化特性如下：(2)具有3→5外切酶活性，但无5→3外切酶活性。(3)对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。(4)不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。?第三节?DNA聚合酶三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)1、概况DNApolⅢ全酶由多种亚基组成，而且容易分解。大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子，因此不易获得纯品，为研究该酶的各种性质和功能带来了许多困难。直到不久前，才对其性质和功能有所了解，但每个亚基的具体作用仍不十分清楚。第三节?DNA聚合酶三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)2、活性特点尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。该酶对模板的要求与DNA聚合酶Ⅱ相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链DNA模板的DNA聚合作用。第三节?DNA聚合酶三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)2、活性特点也有3‘→5’和5‘→3’外切酶活性，但是3‘→5’外切酶活性的最适底物是单链DNA，只产生5‘-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3’端开始切除一个核苷酸。5→3外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。第三节?DNA聚合酶三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)3、生理功能DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度(nonpermissivetemperature)内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。大肠杆菌三种DNA聚合酶的特性功能polⅠpolⅡpolⅢ聚合作用5→3++外切酶活性3→5+++外切酶活性5→3+++焦磷酸解和焦磷酸交换作用+-+模板及引物的选择完整的DNA双链---带引物的长单链DNA+--带缺口的双链DNA+--双链而有间障的DNA+++一般性质分子量109KD120KD＞140KD每细胞中的分子量40017-10010-20结构基因polApolBpolC第三节?DNA聚合酶四、KlenowDNA聚合酶

?1、来源?是E.coliDNApolymeraseⅠ经蛋白酶（枯