ELISA试验基本步骤及材料和试剂.pdf

ELISA基本步骤和主要试剂材料

注意：本步骤为间接ELISA步骤

一主要步骤

1包被取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用

包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。

包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接置4C过夜；也可以先置37C孵育2小时

再转入4C过夜。

2洗涤

包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min,弃掉

洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。

3封闭

常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液

的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于4C过夜，或者置于37E温育2-4h,

具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。

4洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。

5加入一抗

一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验不同需

要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条

件为37E孵育2h。

6洗涤

具体同步骤4。

7加相应HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用

封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔，37C反应。

8洗涤

具体同步骤4。

9显色

常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，，这里只介绍

前者。显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配置显色液，为10ml底

物缓冲液加粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待

OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混

C

匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37°反应约10min。

10终止

将ELISA板取出，每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读

数（OPD为底物是读数波长为490nm，TMB为底物时波长为450nm）。

二材料、试剂

1ELISA板

专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔

式，需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口，特点

是孔大，加满约300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等）

均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约200ul，此时各试剂只需加50ul体

积即可。

2各试剂配制

1）包被液（的碳酸盐缓冲液）

无水

NaHCO30.2856g

SW100ml

C

完全溶解至4,一周内使用

2）PBST配方

NaCl8.0g

2.9g

KCl0.2g

KH2PO40.24g

SW1000ml

3）底物缓冲液

Na2HPO43.682g

柠檬酸1.02g

DW200ml

不需灭菌，4°C保存

4）3%H2O2

30%H2O2100ml

SW900ml

5）显色剂

底物缓冲剂10ml

3%H2O2150ul

OPD15mg

其中H2O2最后加

6）终止液

浓硫酸：SW=1:8

浓硫酸缓慢加入到SW中，并搅拌散热三注意事项

1包被

所谓37C反应，一般取一个37C的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将ELISA板置

于泡沫板上即可，其余步骤的37C反应操作同