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蛋白质测定方法

——学报告

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蛋白质的检测

酚试剂法灵敏度较高费时蛋白质在碱性溶酚类、柠檬

液中其肽键与酸、硫酸铵、

20~250mgCu2+螯合，形成tris缓冲液、甘

蛋白质一铜复合氨酸、糖类、

物，此复合物使甘油等均有干

扰作用

酚试剂的磷钼酸

还原，产生蓝色

化合物

由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面

以实验的形式进行详细阐述：

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1材料与方法

1.1仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、

抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇-乙

醚等体积混合液、浓H2SO4、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0.

050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾-硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩

脲试剂、考马斯亮蓝G-250试剂。

1.2实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸

铵。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂和加入K2SO4以提高溶液的沸点,而加入

30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分

解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出

样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

蛋白质分子中,酪氨酸、苯氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收

紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋

白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸

收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液

的快速连续检测,因为此时需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋

白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,

故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶

及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行

计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽

然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。

此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意

溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白

浓度大约在0.1～1.0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线

得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。

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(3)双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,