胰羧肽酶原B、其同工型和突变蛋白的制备及应用.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN1346407A

(43)申请公布日2002.04.24

(21)申请号C0

(22)申请日2000.03.23

(71)申请人阿文蒂斯药物德国有限公司

地址德国法兰克福

(72)发明人P·哈勃曼

(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所

代理人唐伟杰

(51)Int.CI

C12N15/57

C12N9/48

C12N1/19

C07K14/62

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

胰羧肽酶原B、其同工型和突变蛋

白的制备及应用

(57)摘要

本发明涉及胰羧肽酶B或羧肽酶B

同工型或突变蛋白的制备方法,其中:(a)在微

生物中以分泌形式表达羧肽酶B的天然或

非天然前体形式;(b)纯化以分泌形式表达的

该前体形式;并(c)通过酶处理将纯化的前体

形式转化成有活性的羧肽酶B或其同工型

或突变蛋白。本发明还涉及一种核酸结

构、其在所述方法中的用途及制备方法。

本发明还涉及一种宿主细胞、其制备方法

以及在制备胰羧肽酶原B或其同工型或突

变蛋白的方法中的用途。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

Claim1.制备胰羧肽酶B或羧肽酶B的同工型或突变蛋白的方法，其中

(a)在微生物中以分泌形式表达羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突变蛋白的天然或非

天然前体形式，

(b)纯化该以分泌形式表达的前体形式，并

(c)通过酶处理将纯化的前体形式转化成有活性的羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突

变蛋白。

Claim2.根据权利要求1的方法，其中胰羧肽酶B或其同工型来源于人。

Claim3.根据权利要求1或2的方法，其中天然前体形式相应于羧肽酶原B或羧

肽酶原B的同工型。

Claim4.根据权利要求1或2的方法，其中非天然前体形式具有下述结构：

S-(As)Subx/Sub-E-CB，(I)其中

S是导致表达过程中形成的该融合蛋白从相应微生物分泌的信号肽；

As是任何期望的遗传上可编码的氨基酸；

E是由内肽酶识别序列组成的肽接头；

CB是羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突变蛋白的氨基酸序列；且

X是0-100的整数。

Claim5.根据权利要求1-4之一的方法，其中给所述天然或非天然前体形式连接

一个肽序列，该肽序列使得可以通过亲和层析纯化该前体形式。

Claim6.根据权利要求5的方法，其中连接用于通过亲和层析纯化的序列是1-6

个组氨酸残基，优选4个组氨酸残基。

Claim7.根据权利要求1-6之一的方法，其中用于表达的微生物是巴斯德毕赤酵

母。

Claim8.根据权利要求1-7之一的方法中，其中使用胰蛋白酶、弹性蛋白酶、Xa

因子、胰凝乳蛋白酶或胶原酶，优选胰蛋白酶，用于酶处理。

Claim9.根据权利要求1-8之一的方法，其中步骤(C)在合适的反应条件下、在含

有胰岛素B、C和A链的胰岛素前体形式或胰岛素衍生物存在时进行，并且在此方

法中形成了成熟胰岛素或成熟胰岛素衍生物，再从反应混合物中分离该成熟胰岛素

或成熟胰岛素衍生物。

Claim10.羧肽酶原B和羧肽酶B或其同工型或突变蛋白在权利要求9的方法中

的用途。

Claim11.用于根据权利要求1-9之一的方法的核酸结构，其包含编码羧肽酶B或

羧肽酶B同工型或突变蛋白的天然或非天然前体形式的DNA序列，其中所述编码

序列可操作地与使该前体形式能够在适合微生物中表达的启动子相连。

Claim12.根据权利要求11的核酸结构，其中所述DNA序列编码式I的蛋白质。

Claim13.根据权利要求11或12之一的核酸结构，其中另有