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第二节基因治疗的基本程序
六、外源基因的整合不整合整合随机整合定点整合骨髓干细胞骨髓中至少含有两种干细胞：造血干细胞Hematopoeiticstemcells（HSC）骨髓间质干细胞Bonemarrowstromalcells（MSC）HSC一般处于静止期，必要时才进入细胞周期多能干细胞(造血干细胞,HSC)红系祖细胞定向干细胞(造血祖细胞,HPC)巨核系祖细胞单核系祖细胞成熟的终末细胞1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术骨髓中的非造血干细胞，能分化成多种中胚层来源的间质细胞（骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等）MSC在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不同组织的微环境含有不同因子，促进MSC向不同谱系分化。MSC体外易于分离和培养，回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，因而可作为理想的靶细胞用于基因治疗（直接移植MSC可治疗骨和软骨的疾病）骨髓间质干细胞成纤维细胞是一种容易获得和在体外培养并进行遗传修饰的细胞。经修饰的细胞又容易移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因被转移到小鼠皮肤成纤维细胞，然后再移植回小鼠。这些细胞再体内持续分泌细胞因子，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。成纤维细胞遗传修饰后的成纤维细胞也可移植入脑内，以治疗神经系统疾病国内薛京伦等以逆转录病毒为载体，将人凝血因子IXcDNA在体外转移到两例血友病患者的皮肤成纤维细胞中，用胶原基质包埋后再自体移植回体内，结果IX因子在体内持续高水平表达2年以上，使两患者的出血症状得到不同程度减轻。骨骼肌优点：最常用的注射途径，对外源药物耐受力强；面广量大又位于体表易于操作，是表达外源基因的良好场所。肌细胞外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL）主要优点：1.易于从体内取出和回输。应用IL-2尚可使PBL在体外进行培养并扩增，从而获得足够数量以适应体外操作。2.PBL对目前常用的RV,AAV等都有一定敏感度，可被有效导入外源基因，并可耐受筛选。3.筛选出转导成功的细胞回输体内可继续存活，应用IL-2可使之继续生长且有功能。世界上首例遗传病的基因治疗：ADA缺乏症（SCID）淋巴细胞化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法磷酸钙法DEAE－葡聚糖法电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）第二节基因治疗的基本程序
四、载体携带外源基因进入细胞1）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。细胞细胞膜核膜通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞瞬间第二节基因治疗的基本程序
四、细胞转染利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核（2）显微注射法（microinjection）第二节基因治疗的基本程序
四、细胞转染例：转基因动物的制备重组基因
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