(73)--8.3.2 多肽的结构测定与合成方法.ppt

NH2-NH2100oC5-10hGly-Ala-PheGlyNHNH2AlaNHNH2Phe—C端*(2)羧肽酶水解法（Carboxypeptidasehydrolysis）羧肽酶可以选择性水解游离羧基相邻的肽键，是一催化C-端氨基酸水解的特效酶，溶液中切下的氨基酸即C-端氨基酸。羧肽酶可继续切断已切断了的C-端氨基酸的肽链，如此不断进行，从酶的水解液中定期取出样品进行分析，根据氨基酸出现的先后顺序可推断C-端氨基酸的排列顺序。此法适用于前几个氨基酸测定，否则不可靠。*3.酶部分水解法（Enzymeparticalhydrolysis）测定肽链的氨基酸顺序的关键一步是将长肽链部分水解成小肽，然后将小肽分离，进行氨基酸分析和N-端标记，重复下去便可推知整个肽链氨基酸的顺序。*如，?胰蛋白酶水解法：胰蛋白酶专门水解由碱性氨基酸——赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽链，所以水解后C-端为赖氨酸或精氨酸。?糜蛋白酶能使芳香氨基酸在羧羰基处水解，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。?化学法溴化氰(CNBr)水解法专门水解由蛋氨酸的羧基形成的肽链。*保护基必须具备的条件:（1）易在预定的部位引入；（2）在某特定的条件下，保护基很易除去；（3）引入和除去保护基时，分子中的其它部位不会受到影响，特别是已接好的肽键。多肽合成必须解决下面四个问题1.氨基保护2.羧基保护3.侧链保护4.接肽方法二、多肽的合成方法*1.氨基的保护Benzoxycarbonyl（简写Z）苄氧基甲酰氯氯代甲酸叔丁酯法叔丁氧基甲酰氯简写：Boc-t-Butoxycarbonyl氯代甲酸苯甲酯法*2.羧基的保护-成酯3.侧链的保护去保护基空气中氧化Na,NH3(l)*保护氨基4.接肽方法羧基组分氨基组分活化羧基保护羧基连接（1）溶液法二肽*（2）固相法**罗伯特·布鲁斯·梅里菲尔德(RobertBruceMerrifield)，美国生物化学家（1921.7.15~2006.5.14），因“固相化学合成方法的贡献”而荣获1984年的诺贝尔化学奖。先来看多肽的结构是如何测定的，在测定肽或蛋白质的一级结构（氨基酸顺序）前，需要进行下面几项准备工作：（1）测定分子中是否存在二硫键若分子中含二硫键，可通过酸氧化的方法切断。二硫键氧化成-SO3H（磺酸基），半胱（膀胱的guang）氨酸以磺酸基丙氨酸单元存在。如没有-S-S-，则不需处理。（2）检测氨基酸的组成及其相对比例可在氨基酸自动分析仪上进行测定。（配图讲）氨基酸自动分析仪内有两根离子交换柱，一为分离碱性氨基酸和碱性物，二为分离其他氨基酸。将氨基酸水解液分别通过柱子，然后用适当pH溶液洗脱，洗脱液自动与茚三酮溶液混合，产生的紫色通过光电比色计，光电比色计对不同时间流出的洗脱液自动作出曲线，曲线峰的面积代表各氨基酸的相对含量。其洗脱时间与已知氨基酸混合物的曲线比较即可确定为何种氨基酸。该方法可用微克级样品进行分析，结果迅速、准确。（3）测定肽或蛋白质中各氨基酸的排列顺序。分析方法分为端基分析法和部分水解法。这是一项很复杂的工作，通常可采用几种方法配合使用进行推断，主要采用端基分析法和酶部分水解法。准备工作进行完毕后，可用以下三种方法进行测定肽链或蛋白质中氨基酸的顺序：第一种是N-端氨基酸单元分析法，思路是在N-端引入具有特定基团的标记化合物，这种标记基团有颜色、荧光、紫外吸收等性质，然后分离鉴定具有这种基团的氨基酸衍生物。N-端氨基酸单元分析法又细分为两种方法，其一为二硝基氟苯法，（又称桑格尔法），简称DNFB法。此法是在1945年由英国生化学家Sanger提出，2，4二硝基氟苯很活泼，易与N-端-NH2（氨基）反应形成DNP-多肽。彻底水解后，水解物中只有一种DNP-氨基酸黄色沉淀，各种氨基酸的DNP都是黄色，且各有一个Rf值，因此易于鉴别，从而确定N-端氨基酸种类。其二为艾德满（Edman）法，(又称异硫氰酸苯酯法)，（简称PITC法）。1950年，Edman?P提出：用异硫氰酸苯酯与N端氨基生成苯氨基硫代甲酸衍生物，然后在无水氯化氢作用下发生关环形成一个苯基乙内酰硫脲的衍生物，从肽键上断裂下来，而肽链中的其它酰胺键不受影响，此种标记N-端氨基酸的方法叫做艾德满（Edman）法。（如图示）其中，苯基乙内酰硫脲衍生物可用萃取法分离，气-液色谱法测定。此法的特点是：只除去N端氨基酸，余下的肽键仍是完整的。可继续用该法