重组克隆的单元操作.ppt

接合转化过程供体菌(待转化的重组质粒的菌株），不能在最小培养基中生长，但抗生素XR辅助菌(含辅助质粒的菌株），不能在最小培养基中生长，但抗生素YR受体菌,能在最小培养基中生长在无抗生素的培养基中混合培养一段时间后含有X+Y的最小培养基第127页,共145页，星期六，2024年，5月四、转化率及其影响因素1、转化率的定义定义1：待转化的DNA分子远大于受体细胞的条件下，转化细胞与细胞总数之比。定义2：受体细胞相对于DNA分子大大过量时，每微克DNA转化所产生克隆数。（每微克DNA进入受体细胞的分子数）第128页,共145页，星期六，2024年，5月四、转化率及其影响因素2、转化率的用途参照已知转化率和重组率可以帮助设计DNA重组实验的规模，如平板的制备数量第129页,共145页，星期六，2024年，5月四、转化率及其影响因素3、转化率的影响因素载体DNA及重组DNA：构象和大小受体细胞转化操作：选择适合转化方法和优化操作流程第130页,共145页，星期六，2024年，5月2.3.5转化细胞的扩增转化细胞的增殖载体携带标记基因拷贝数扩增及表达克隆外源基因的表达第131页,共145页，星期六，2024年，5月2.4转化子的筛选与重组子的鉴定非转化子：未接纳载体或重组子的非转化细胞转化子：接纳载体或重组分子的的转化细胞重组子：含有重组DNA分子的转化子非重组子：含有空载体分子的转化子期望重组子：含有目的基因的重组子非期望重组子：不含目的基因的重组子第132页,共145页，星期六，2024年，5月2.4.1基于载体遗传标记的筛选与鉴定载体DNA分子上多携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。在合适的培养基上：转化子生长（菌落或噬菌斑）非转化子不生长第133页,共145页，星期六，2024年，5月2.4.1.1抗药性筛选方法载体上含有抗生素的抗性基因受体细胞对载体上抗生素敏感受体细胞只有获得了载体后，才能在含有抗生素的培养基上生长。第134页,共145页，星期六，2024年，5月BamHIBamHIPstIPstI含有？抗生素的培养基上生长含有？抗生素的培养基上生长正选择只能筛选转化子BamHIBamHI含有？抗生素的培养基上生长BamHIBamHI第135页,共145页，星期六，2024年，5月含有氨苄抗生素的培养基上生长BamHIBamHI筛选重组子含有氨苄抗生素的培养基氨苄四环素的培养基？？？？？？？第136页,共145页，星期六，2024年，5月A)lacoperon结构以及表达特性2.4.1.2显色模块筛选法lacZ:β-gallactosidase(β-半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lacY:lactosepermease（半乳糖苷透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lacA:transacetylase（半乳糖苷乙酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)lacI:乳糖阻遏蛋白基因Plac:乳糖代谢结构基因的启动子PI:阻遏蛋白基因的启动子CAP：代谢激活蛋白结合位点第137页,共145页，星期六，2024年，5月阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳糖结构类似的物质如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖）结合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，称为安慰性诱导物第138页,共145页，星期六，2024年，5月乳糖操纵子利用β-半乳糖苷酶及其基因β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中β-半乳糖苷酶的活性。第139页,共145页，星期六，2024年，5月α－互补（蓝白菌落筛选或称x－gal筛选载体Puc系列（PUC18/19）带有E.coliDNA的短区段，含：(1)LaczM15编码β－半糖苷酶N端的146个AA信息也称α－肽；(2)编码区插入一个MCS并不破坏阅读框，少数几个AA插入到该酶的N端而不影响其功能；(3)Plac可以启动Lacz的转录，表达，但受阻pr.阻遏，IPTG（异丙基硫代β－半乳糖苷）能够去阻遏。JM103受体菌含lacz(c)编码β－半乳糖苷酶的C端部分α－互补当载体转入JM103lacz(n)与lacz(c)α互补，编码具有活性酶pr→使底物X-gal生色（5溴4氯3吲哚β－半乳糖苷产生兰菌落）。当MCS插入外源gen