新型枝孢霉菌株对果蔬农药残留的原位生物降解新技术.doc

新型枝孢霉菌株对果蔬农药残留的原位生物降解新技术

新型枝孢霉菌株对果蔬农药残留的原位生物降解新技术

摘要：本文从农药厂生产废水和贵州省原始森林无污染泉水两种极端环境中筛选获得多种对毒死蜱和氯氰菊酯降解效果达到80%以上的菌株，其中一种经经典形态学方法和分子生物学方法鉴定为Cladosporiumcladosporioides(Fresen)deVries。经HPLC测定，该菌处理后5d，对5～500mg/L毒死蜱和1～100mg/L氯氰菊酯的最高降解效果均可达90%以上。确定最适培养基为查彼氏培养基，经济高效且稳定。该降解菌液对小白鼠生长发育在常规剂量无任何不良影响，该菌液制剂常规条件下保存30d以上活性降低不明显，对盆栽芥兰毒死蜱残留的降解率高达80%以上，降解效果明显。本发明作品为食品安全生产提供了农药残留控制新技术新产品，提出了果蔬农药残留的“原位生物降解”新概念理念，产品应用前景极为广阔，具有理论和实践上的重要意义。

关键词：农药残留，降解，高效降解菌

第一部分高效降解菌的筛选与活性

1材料与方法

11供试微生物

从2004年1月开始，分别从贵州省遵义市鸡顶山取回贫营养土样和水样中山凯达精细化工厂废水处理池中取回未处理污泥和废水样品，在培养基中添加拟毒死蜱和高效氯氰菊酯原药，自主分离筛选获得单一纯化真菌菌落，分别编号，测定各菌种对农药的降解效能。取同等条件下农药降解率最高的菌株，进行分离培养和进一步研究。筛选获得的高效降解菌种采用液体石蜡保存法和砂土保存法保存于华南农业大学昆虫毒理研究室胡美英教授课题组。

12供试药剂与试剂

供试药剂：932%高效氯氰菊酯由江苏扬农股份化工有限公司提供。970％毒死蜱由美国陶氏益农公司惠赠。本文各实验供试农药浓度均折算成100%计。降解菌培养和农药降解研究过程中所用均为国产常规试剂(分析纯)和材料。

13主要仪器

生化培养箱(HR-250A)立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-3OS)旋转蒸发仪(LABORTA4001)（德国Heidolph公司）低温冷冻多管离心机(TDL-5000B型)冷冻高速离心机HP-1100型高效液相色谱仪HS-3C精密pH计等常规仪器设备。

14培养基种类的筛选

将预培养3d的降解菌培养液于4800rpm离心10min，取01g湿菌体在无菌条件下分别接入装有50ml下述5种不同培养基的250ml三角瓶，置于气浴恒温振荡器中（28℃，150rpm）振荡培养5d后，将培养物用双层滤纸过滤，然后用蒸馏水清洗3遍，菌体连同滤

（1）查彼氏培养基（Czapekmedium）：硝酸钠：20g，氯化钾：050g，硫酸镁：050g，磷酸氢二钾：100g，硫酸铁：001g，蔗糖：3000g，琼脂：180g，蒸馏水：1000ml。按以上次序，将各成分加入蒸馏水中，灭菌备用。

（2）马铃薯葡萄糖培养基（Potatodextrosemedium,PD）：马铃薯：20000g，葡萄糖：2000g，蒸馏水：1000ml。将无病马铃薯洗净去皮切碎，加蒸馏水1000ml煮沸05ml，纱布过滤，滤液加蒸馏水补足1000ml，再加入葡萄糖，然后分装三角瓶灭菌备用。

（3）理查德培养基（Richardmedium）：硝酸钾：100g，磷酸氢二钾：500g，硫酸镁：25g，氯化铁；002g，蔗糖：500g，蒸馏水：1000ml。按以上次序，将各成分加入蒸馏水中，分装三角瓶灭菌备用。

（4）燕麦片培养（oatmealmedium,OM）：燕麦片：300g，蒸馏水：1000ml。将燕麦片加蒸馏水1000ml，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加蒸馏水补足1000ml，分装三角瓶灭菌备用。

（5）玉米粉液体培养基（cornmealmedium,CM）：玉米粉：300g，蒸馏水：1000ml。将玉米粉加蒸馏水1000ml，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加水补足1000ml，分装三角瓶灭菌备用。

15降解菌分离筛选和形态及分子鉴定

采用平板稀释法和富集培养法分离纯化得到降解菌，测定菌种对高效氯氰菊酯和毒死蜱降解率，获得高效降解菌株(王兆守等,2003)。参考文献(王兆守等，2003)，利用HPLC法测定高效氯氰菊酯和毒死蜱残留量，计算菌株对供试药剂的降解率（％）=（对照农药残留量－处理农药残留量）/对照农药残留量×100

菌种的初步鉴定参考文献方法(方中达，1999；中国科学院中国孢子植物志编辑委员会，2003)及微生物教材，显微镜下观察各种降解真菌孢子孢子囊孢囊梗分孢器等形态学特征，测量相关指标，根据初步形态观察，初步鉴定各种降解真菌归属。

采用分子生物学的方法鉴定筛选所得菌种。抽提DNA，ITS扩增及产物割胶纯化，用pTA2载体克隆该片段，挑单