目的基因导入受体细胞专业知识讲座.pptx

第三节重组子筛选;将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持受体细胞统称为克隆子。

把采取各种转化方法或转导方法取得克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在受体细胞称为转化子），现在这二者有通用趋向。

含有重组DNA分子克隆子被称为重组子，假如重组子中含有外源目标基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。

经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，取得所需阳性克隆子过程称为克隆子筛选。;一、遗传表型直接筛选法;

;惯用选择标识基因主要是：

抗性基因；

表示产物能够发光或使反应底物显色基因;选择培养基是：

依据宿主细胞类型配置培养基，对于细菌受体细胞而言，通惯用LB培养基，在LB培养基中加入适量某种选择物，即为选择培养基。

选择物：

是由载体DNA分子上携带选择标识基因所决定。;（一）依据载体选择标识初步筛选转化子;（1）抗药性筛选;目的基因导入受体细胞专业知识讲座;正向选择方式;注意：

利用含一个选择药品选择培养基无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。;（2）插入失活筛选法;双抗药性筛选;目的基因导入受体细胞专业知识讲座;（3）插入表示筛选法;比如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因上游含有一段λ噬菌体DNACI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表示阻遏蛋白能够抑制Tcr基因表示。当外源DNA片段插入CI基因HindⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因妨碍解除而得以表示，故阳性重组子为Tcr表型。

质粒本身因为Tcr基因受妨碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段阳性重组子转化菌才能生长成菌落。;（4）显色互补筛选法;;lacZ基因上缺失操纵基因区段突变体与带有完整近操纵基因区段β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。

含有完整乳糖操纵子菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。假如在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失片段(lacZ’)．则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG培养基中得到转化子是蓝色菌落。;lacZ’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失DNA片段，含lacZ’重组载体转化lacZ’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lacZ’互补型菌株本身为白色菌落。当lacZ’区插入外源基因后，再转化lacZ’互补型菌株，因为不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG培养基上也只能长成白色菌落。这么能够区分含外源基因和不含外源基因转化子。

此方法主要用于原核生物。;α互补检测

;;以显色剂x-gal作为选择物时:

DNA对照组不应出现任何菌落；

感受态细胞对照组长出菌落应全是蓝色；

感受态细胞有效性对照组长出菌落中应有白色。

其中一项不符，就有可能挑出假转化子菌落。;（5）利用汇报基因筛选植物转化细胞;特征

作为汇报基因，在遗传选择和筛选检测方面必须含有以下几个条件：

(1)已被克隆和全序列已测定；

(2)表示产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染细胞中无相同内源性表示产物；

(3)其表示产物能进行定量测定。;①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子选择标识基因。

②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标识基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。

③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子标识基因。;④β-葡萄糖酸酶基因（gus）;⑤萤火虫荧光素酶基因（luc）;⑥抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成份除草剂含有抗性。;（6）利用遗传选择标识筛选哺乳动物转基因细胞;胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等表示产物直接或间接参加核苷酸合成代谢。

这些基因缺失缺点型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加一些核苷酸培养基中才能生长。

假如用这么缺点型细胞作为受体细胞，导入含有上述基因外源DNA，补充原来缺失基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，能够在不添加核苷酸培养基中正常生长。依据这一性质能够在不添加核苷酸培养基中筛选出转化子。;三、核酸分子杂交检测法（p239）;待测核酸序列;;依据待测核酸起源以及将其分子结合到固相支