分子诊断项目.pptx

分子诊断项目分子诊断项目第1页

2内容1.HBV-DNA荧光定量PCR2.流式基础应用3.染色体核型分析分子诊断项目第2页

3HBVDNA荧光定量PCR分子诊断项目第3页

4 PCR技术介绍1985年美国PE-cetus企业人类遗传研究室mullis等人创造了含有划时代意义PCR技术，从而使大家梦寐以求体外扩增核酸片段愿望成为现实。1988年PE-cetus企业推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术自动化成为现实。Mullis出因其卓越贡献与寡核苷酸基因定点诱变创造者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。伴随PCR技术日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法分子诊断项目第4页

5PCR基础原理类似DNA体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板特征，在附加一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链过程。分子诊断项目第5页

6DNA合成必备要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer分子诊断项目第6页

7定量PCR概念以外参或内参为标准，经过对PCR终产物分析或PCR过程监测，对PCR起始模板量定量分子诊断项目第7页

8常规PCR与定量PCR比较分子诊断项目第8页

9实时荧光定量PCR原理指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定义：每个反应管荧光信号抵达设定阈值时所经历循环数。荧光阈值（threshold)缺省设置是3-15个循环荧光信号标准偏差10倍，即：threshold=10×SDcycle0-15分子诊断项目第9页

10Ct值与起始模板关系每个模板Ct值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数标准品作出标准曲线，只要取得未知样品Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。分子诊断项目第10页

11荧光定量标准曲线标准曲线未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target38分子诊断项目第11页

12荧光检测模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探针（Taqman）（3）杂交探针（HybridizationProbes）（4）分子信标（molecularbeacon)发夹引物（sunriseprimer)蝎状引物（scorpionprimer)复合探针（complexprobes)分子诊断项目第12页

13探针5端标识一个荧光基团，3标识另一个荧光基团。5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近3’端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出荧光信号。Taqman探针原理分子诊断项目第13页

14当溶液中模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物介导下，Taq酶沿模板向前合成子链，当延伸至探针结合处，发生链置换；Taqman探针原理分子诊断项目第14页

15Taqman探针原理Taq酶5‘—3’外切酶活性将探针5‘端连接荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团屏蔽，发出荧光，荧光信号与PCR产物数量成百分比。所以依据PCR反应液荧光强度即可计算出初始模板数量。分子诊断项目第15页

16定量PCR在乙肝检测中意义1.判断疾病严重程度和传染性2.PCR结果与血清免疫学结果综合评价3.观察抗病毒药品疗效，指导药品用量4.献血员窗口期病毒核酸筛查及早期诊疗5.预测病情、判断预后6.器官移植、母婴垂直传输分子诊断项目第16页

17分子诊断项目第17页

18标本留取及检测步骤标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本防止溶血和脂血。检测步骤：1.反应液配制2.核酸提取3.核酸扩增结果分析：采取样点拟正当，由标准曲线得到病毒拷贝或IU/ML。分子诊断项目第18页

191.分区操作：PCR含有超敏感性，所以在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。2.试验前试验室应使用紫外消毒最少30分钟。3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时防止飞溅。注意事项分子诊断项目第19页

204.天天试验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，试验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5.全部试剂试验前充分融化，防止重复冻融。6.每次PCR反应均应设置阴阳性对照。注意事项分子诊断项目第20页

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