单链内切核酸酶.pptx

单链内切核酸酶单链内切核酸酶第1页

2024/7/82本节重点：1.S1核酸酶活性和应用。2.Bal31核酸酶活性和应用。3.脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)活性和应用。单链内切核酸酶第2页

2024/7/83一、S1核酸酶S1核酸酶起源于米曲霉菌，是一个含锌蛋白质，相对分子质量为3，相对耐热，由nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是一个高度单链特异性内切核酸酶，催化反应需要Zn2+和酸性条件，最正确pH4.0~4.5。单链内切核酸酶第3页

2024/7/84S1核酸酶特征：（1）在高离子强度、pH4.2和1mmol/LZn2+存在条件下，S1核酸酶能够高特异性地降解单链DNA和RNA，包含双链分子中单链区域（如发卡结构），反应产物为5单核苷酸。单链内切核酸酶第4页

2024/7/85（2）调整S1核酸酶用量，能够切割双链DNA单链缺刻，但不能识别单个碱基正确错配。（3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸降解，但该酶降解单链DNA速度是降解双链DNA75000倍。单链内切核酸酶第5页

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2024/7/87S1核酸酶应用：（1）可用于切掉DNA片段单链突出末端以产生平末端；（2）打开双链cDNA合成中发夹环结构；（3）S1核酸酶作图法在测定杂交核酸分子杂交程度、RNA分子定位、确定内含子位置、内含子和外显子剪切位点定位、转录起始位点与终止位点测定中，S1核酸酶都是十分有效工具。单链内切核酸酶第7页

2024/7/88S1核酸酶活性可被PO43-、5核苷、核苷三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低溶度变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在条件下稳定。单链内切核酸酶第8页

2024/7/89二、Bal31核酸酶Bal31核酸酶特征：?对单链DNA含有特异内切酶活性，可从3-OH末端快速降解DNA。?对于线性双链DNA分子，它表现为3→5端外切酶活性和5→3外切酶活性，可有控制地从3末端和5末端逐一水解除去单核苷酸，产生缩短了DNA分子。（注意：Bal313外切酶活性约为它单链特异性内切酶活性20倍）单链内切核酸酶第9页

2024/7/810?当底物是双链环形DNA分子时，Bal31单链特异性内切核酸酶活性，经过对单链缺口或瞬时单链区降解作用，将超螺旋DNA切割成开环结构，进而成为线性双链DNA分子。?除此以外，Bal31核酸酶还可起到核糖核酸酶作用，催化核糖体和tRNA降解，但它不含有双链特异核酸外切酶活性。单链内切核酸酶第10页

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2024/7/812Bal31核酸酶应用：Bal31核酸酶降解DNA需要Ca2+存在，在反应不一样阶段加入螯合剂—EGTA（乙二醇双β－氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。（1）用于确定DNA片段限制酶图谱使用Bal31核酸酶降解待测DNA，在不一样反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然后，各样品用对应限制性内切核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定次序消失。单链内切核酸酶第12页

2024/7/813限制酶图谱就是一系列限制酶特异识别序列在DNA链上出现频率和它们之间相对位置。它实际上就是限制酶特异切点在DNA上定位，表现出一些部位线性序列，它是DNA分子结构特异性反应，所以限制酶图谱又称DNA物理图谱。单链内切核酸酶第13页

2024/7/814（2）可用于在克隆前经过可控方式去除双链DNA末端不需要序列。处理后DNA末端，可用T4噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段补平，再加入合成接头，插入适当载体。用此方法，还能够在DNA上生成一系列终点确定缺失突变体。（3）用于确定DNA分子二级结构单链内切核酸酶第14页

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2024/7/816三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ脱氧核糖核酸酶Ⅰ简称DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ），是起源于牛胰脏糖蛋白。它是一个需要二价阳离子内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成含有5磷酸末端寡核苷酸。当有Mg2+存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在时，则在双链DNA大致同一位置上切割，产生平末端DNA片段。单链内切核酸酶第16页

2024/7/817脱氧核糖核酸酶Ⅰ应用：在分子克隆中，DNA酶Ⅰ主要用于：?与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ联合参加切口平移法标识DNA分子；?在Mn2+存在下，随机裂解