PCR技术及其应用-PPT.ppt

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2024-07-18 发布于河北
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PCR技术及其应用

WhatisPCRHowtoPCRWhydoPCR2

Developedin1983byKaryMullispolymerasechainreaction(PCR)1993年的诺贝尔化学奖3

AnimationofPCR4

PCRReagentsTemplateDNAPrimersdNTPDNAPolymeraseBufferMg2+5

QuestionsAnneallingDNApolymerasev.s.WhyprimersareessentialforDNApolymerase?6

大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流7

InitializationstepDenaturationstepAnnealingstepElongationstepFinalelongationFinalholdPCRprocedurestages20~40CyclesExponentialamplificationLevelingoffstagePlateau8

EvolutionofmachinesforPCR12349

PCROptimizationContaminationHairpinsPolymeraseerrorsMagnesiumconcentrationNon-specificprimingPrimerdimersDeoxynucleotidesGC-richTemplateProofreadingDNAPolymerasePfu,KOD…DMSO,betaineRedesignPrimersHot-StartPolymerase10

PCROptimization:PrimerDesignSoftwaresPrimerpremier:e-PCR(NCBI)Oligo7:Primer3:CommandlinestyledesigntoolMulti-OligodesignforprobesorprimersSinglepairedprimersdesignforPCRAvoidnon-specificamplificationbyblast11

Primersforamplificationofhumanb-actingenomicDNAregion12

PrimerDesign:avoidfailureofamplification5’-primer:stem-loopstructurewithhighmeltingtemperature13

Highdifferencebetweenproductandprimermeltingtemperatures.3-endForwardPrimerdimer.PrimerDesign:avoidfailureofamplification3-enddimerbetweentheForwardandReverseprimers.TerminalstabilityoftheForwardPrimeristoohigh.14

PrimerDesign:avoidfailureofamplification15

PCRmethods16

IsothermalPCRReverseTranscriptionPCRFrequentlyusedPCRmethodsReal-TimePCR(quantitativePCR)Overlap-extensionPCRNestedPCR17

FrequentlyusedPCRmethodsReverseTranscriptionPCR18

Overlap-extensionPCRFrequentlyusedPCRmethods19

NestedPCRFrequentlyusedPCRmethods20

FrequentlyusedPCRmethodsReal-TimePCR(quantitativePCR)DetectfluorescenceforeachcycleQuantitaivebyamplificationcurveQuanlitycontrol21

Real-TimePCRdouble-strandedDNA-bindingdye22

Real-TimePCR(quantitativePCR)Detectfluorescencef

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