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2023版中国药细菌内毒素检查法验证明施方案
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个人收集整理，勿做商业用途
记录编码：LZ-B00-T023-010-A 序号：
北京灵泽医药技术开发
一次性肠外养分输液袋
内细菌毒素检查法验证方案
李树权
日期：2023.11.7
日期：日期：
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验证目的
为公司产品细菌内毒素检测方法供给依据。
验证依据
《中华人民共和国药典》2023年版其次部附录ⅪE细菌内毒素检查法
验证条件
无菌操作间〔万级〕
验证预备
设备名称设备编号
设备名称
设备编号
设备状态
内毒素检测仪
A10-2023-A-004-0
完好
鼓风式枯燥箱
A10-2023-A-007-1
完好
试剂名称来源
试剂名称
来源
批号
内毒素工作品〔10EU/ml〕
湛江博康海洋生物
1107010
鲎试剂(0.25EU/ml)
湛江博康海洋生物
1206110
内毒素检查用水
湛江博康海洋生物
120406
样品：
样品名称
样品名称
规格型号
批号
数量
一次性肠外养分输液袋
PN-E-W3500ml
2
4.4试验前预备：
试验用具移液管〔或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头〕、凝集管〔10mm×75mm〕、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、耐热器皿须经180℃烘烤120min。假设使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，置30%双氧水中浸泡4小时，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后60℃烘干备用。或用一次性无热源吸头。
样品制备〔供试液溶液〕
将20ml内毒素检查用水注入到一次性肠外养分输液袋内，37℃孵育60min。作为供
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试品溶液。
鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。因此要求试验室在使用一批的鲎试剂进展供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必需进展鲎试剂灵敏度复核试验。
试验操作
细菌内毒素标准溶液的制备：
取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内；
依据标准品说明书，参与规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。然后进展稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ〔λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度〕，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟〔具体过程请参见标准品使用说明书〕。
待复核鲎试剂的预备：
取规格为0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用。每支参与0.1mL检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避开产生气泡。假设待复核鲎试剂的规格不是0.1mL/支时，取假设干支按其标示量参与检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1mL分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。
加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支〔管〕放在试管架上，排成5列，其中4列4支〔管〕，每支分别参与0.1mL2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；1列2支〔管〕，每支分别参与0.1mL检查用水。
加样完毕后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避开产生气泡，连同试管架放入〔37±1〕℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(60±2)min。
观看并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避开振动，将
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每管拿出缓缓倒转180°观看，假设管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为〔＋〕；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为〔-〕。保温存拿取试管过程应避开受到振动造成假阴性结果。
试验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性比照为阴性时试验为有效，按下式计算反响终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果〔λc〕：
λc=antilg(∑X/4)；
式中X为反响终点浓度的对数值〔lg〕,反响终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最终一个呈阳性结果的浓度。
结果推断
内毒素浓度〔EU/mL〕0.50.250.1250.0625N
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