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用于鉴定acc脱氨酶结构基因的引物及方法

专利名称：用于鉴定acc脱氨酶结构基因的引物及方法

技术领域：

本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及针对微生物1-

氨基环丙烷-1羧酸(ACC)脱氨酶结构基因设计的通用特异性

简并引物和用聚合酶链式反应(PCR)从根瘤菌等细菌中扩增

ACC脱氨酶结构基因(acdS)的方法。

背景技术：

植物遭受旱涝、盐碱、高低温、重金属等逆境胁迫和病原微

生物侵染会应激产生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯会抑

制植物根伸长、促植物器官衰老和脱落、加重病症。ACC是

植物合成乙烯的直接前体。有些定殖在植物体内外的细菌能

吸收植物细胞分泌出来的ACC,并用ACC脱氨酶催化ACC脱氨

基反应，生成α-酮丁酸和NH3作为细菌生长所需的碳氮源。

与此同时，植物细胞内的ACC浓度下降，相应地ACC氧化成

乙烯的量降低，从而消减在逆境下乙烯对植物生长的抑制，

延缓植物器官的衰老或病害的发展。由于植物不能靠运动选

择适宜生长的地方而免不了生长在逆境中，与植物紧密联合

的有ACC脱氨酶的细菌往往会比有固氮、溶磷或分泌铁载体

等特性的细菌更易产生促植物生长的效应；ACC脱氨酶也就

被认为是细菌促植物生长的一种重要特性(Glicketal.

CriticalReviewsofPlantSciences2007,26:227-242)。

随着全球气候变暖，自然灾害频发，环境污染日益严重，利

用微生物帮助植物抗逆和修复污染的土壤和水体受到人们

的重视，大量的有ACC脱氨酶的细菌被分离和筛选出来，显

示出促植物生长、抗逆和清除污染物的效益。根瘤菌与豆科

植物共生体系的固氮能力是自然界多种生物固氮体系中最

强的，固氮量占地球生物固氮量的65%以上。根瘤菌若能高

效结瘤和固氮，一方面侵染力要强，能够躲避或压制植物把

根瘤菌作为外来入侵物而产生的防卫反应，另一方面要适应

植物的生存环境，能耐受干旱、高盐、偏酸碱或高低温等逆

境或称非生物胁迫。筛选能耐受非生物胁迫的根瘤菌只需操

作自由培养状态的根瘤菌，相对便捷。筛选侵染力强的根瘤

菌，通常要逐一接种相应的豆科植物，培养一段时间后，检

测根部的结瘤数和接种根瘤菌的占瘤率；若要从数量较多的

根瘤菌菌株中筛选出侵染力强的菌株往往需要较大的培养

空间，耗时耗力。早在20世纪70年代就有研究发现乙烯抑

制根瘤菌结瘤和固氮，90年代的研究发现根瘤菌侵染引发豆

科植物产生ACC和乙烯，近十年的研究发现有些根瘤菌有

ACC脱氨酶，它们的ACC脱氨酶结构基因(accK)在根瘤中的

表达量很高，如果把根瘤菌的acdS敲除，根瘤菌的结瘤能

力会显著降低(Uchiumietal.JournalofBacteriology

2004,1862439-2448)；相反，如果向原本没有ACC脱氨酶

的根瘤菌导入acdS，那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固

氮效率显著高于野生型菌株(Maetal.Appliedand

EnvironmentalMicrobiology2004,70:5891-5897)。有一研

究检测了10个商业化生产应用的根瘤菌菌株发现有一半(5

个)的菌株有acdS和ACC脱氨酶活性(Maetal.Antonie

vanLeeuwenhoek2003,83:285-291)。这些研究都表明有

ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力，能高效结瘤；筛选有ACC

脱氨酶的根瘤菌能更可预测地实现与豆科植物高效结瘤固

氮。ACC脱氨酶在多个纲目的细菌和真菌中存在。检测细菌

是否有ACC脱氨酶通常用含有ACC的培养基来培养细菌并诱

导细菌的ACC脱氨酶活性，再用比色法检测ACC脱氨酶催化

ACC脱氨的产物-α-酮丁酸。但有研究发现有些根瘤菌有

acdS，但在自生状态下没有ACC脱氨酶活性(Maetal.

AntonievanLeeuwenhoek2003，83:285-291)，只在与豆

科植物共生的根瘤中表达acdS(Uchiumietal.Journalof

Bacteriology2004，186:2439-2448；Nukuietal.

AppliedandEnvironmentalMicrobiology2006,72

4964-4969)。这样，要鉴定细菌是否有ACC脱氨酶