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用于鉴定acc脱氨酶结构基因的引物及方法
专利名称:用于鉴定acc脱氨酶结构基因的引物及方法
技术领域:
本发明属于应用微生物技术领域,具体涉及针对微生物1-
氨基环丙烷-1羧酸(ACC)脱氨酶结构基因设计的通用特异性
简并引物和用聚合酶链式反应(PCR)从根瘤菌等细菌中扩增
ACC脱氨酶结构基因(acdS)的方法。
背景技术:
植物遭受旱涝、盐碱、高低温、重金属等逆境胁迫和病原微
生物侵染会应激产生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯会抑
制植物根伸长、促植物器官衰老和脱落、加重病症。ACC是
植物合成乙烯的直接前体。有些定殖在植物体内外的细菌能
吸收植物细胞分泌出来的ACC,并用ACC脱氨酶催化ACC脱氨
基反应,生成α-酮丁酸和NH3作为细菌生长所需的碳氮源。
与此同时,植物细胞内的ACC浓度下降,相应地ACC氧化成
乙烯的量降低,从而消减在逆境下乙烯对植物生长的抑制,
延缓植物器官的衰老或病害的发展。由于植物不能靠运动选
择适宜生长的地方而免不了生长在逆境中,与植物紧密联合
的有ACC脱氨酶的细菌往往会比有固氮、溶磷或分泌铁载体
等特性的细菌更易产生促植物生长的效应;ACC脱氨酶也就
被认为是细菌促植物生长的一种重要特性(Glicketal.
CriticalReviewsofPlantSciences2007,26:227-242)。
随着全球气候变暖,自然灾害频发,环境污染日益严重,利
用微生物帮助植物抗逆和修复污染的土壤和水体受到人们
的重视,大量的有ACC脱氨酶的细菌被分离和筛选出来,显
示出促植物生长、抗逆和清除污染物的效益。根瘤菌与豆科
植物共生体系的固氮能力是自然界多种生物固氮体系中最
强的,固氮量占地球生物固氮量的65%以上。根瘤菌若能高
效结瘤和固氮,一方面侵染力要强,能够躲避或压制植物把
根瘤菌作为外来入侵物而产生的防卫反应,另一方面要适应
植物的生存环境,能耐受干旱、高盐、偏酸碱或高低温等逆
境或称非生物胁迫。筛选能耐受非生物胁迫的根瘤菌只需操
作自由培养状态的根瘤菌,相对便捷。筛选侵染力强的根瘤
菌,通常要逐一接种相应的豆科植物,培养一段时间后,检
测根部的结瘤数和接种根瘤菌的占瘤率;若要从数量较多的
根瘤菌菌株中筛选出侵染力强的菌株往往需要较大的培养
空间,耗时耗力。早在20世纪70年代就有研究发现乙烯抑
制根瘤菌结瘤和固氮,90年代的研究发现根瘤菌侵染引发豆
科植物产生ACC和乙烯,近十年的研究发现有些根瘤菌有
ACC脱氨酶,它们的ACC脱氨酶结构基因(accK)在根瘤中的
表达量很高,如果把根瘤菌的acdS敲除,根瘤菌的结瘤能
力会显著降低(Uchiumietal.JournalofBacteriology
2004,1862439-2448);相反,如果向原本没有ACC脱氨酶
的根瘤菌导入acdS,那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固
氮效率显著高于野生型菌株(Maetal.Appliedand
EnvironmentalMicrobiology2004,70:5891-5897)。有一研
究检测了10个商业化生产应用的根瘤菌菌株发现有一半(5
个)的菌株有acdS和ACC脱氨酶活性(Maetal.Antonie
vanLeeuwenhoek2003,83:285-291)。这些研究都表明有
ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力,能高效结瘤;筛选有ACC
脱氨酶的根瘤菌能更可预测地实现与豆科植物高效结瘤固
氮。ACC脱氨酶在多个纲目的细菌和真菌中存在。检测细菌
是否有ACC脱氨酶通常用含有ACC的培养基来培养细菌并诱
导细菌的ACC脱氨酶活性,再用比色法检测ACC脱氨酶催化
ACC脱氨的产物-α-酮丁酸。但有研究发现有些根瘤菌有
acdS,但在自生状态下没有ACC脱氨酶活性(Maetal.
AntonievanLeeuwenhoek2003,83:285-291),只在与豆
科植物共生的根瘤中表达acdS(Uchiumietal.Journalof
Bacteriology2004,186:2439-2448;Nukuietal.
AppliedandEnvironmentalMicrobiology2006,72
4964-4969)。这样,要鉴定细菌是否有ACC脱氨酶
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