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Western-blot(蛋白印迹法)详细步骤
准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1
若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）
步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.
③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）
准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床
步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
②按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。
孔号
0
1
2
3
4
5
6
蛋白标准液（μl）
0
1
2
4
6
8
10
去离子水（μl）
10
9
8
6
4
2
0
蛋白含量（μg）
0
1
2
4
6
8
10
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μlBCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。
2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl]
3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。
4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。
SDS蛋白质电泳
(一)、配胶
准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子
步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。
②首先配制分离胶（一般用12%的SDS分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。
③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。
④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。
⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。
注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。
2.12%分离胶配方：
不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）
溶液成分
5
10
15
20
25
30
H2O
1.6
3.3
4.9
6.6
8.2
9.9
30%Arcylamide
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
1.0MTris-HCL(PH8.8)
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.20
0.25
0.30
10%APS
0.05
0.1
0.15
0.20
0.25
0.30
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
3.SDS浓缩胶配方（5%Arcylamide）
不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）
溶液成分
2
3
4
5
6
8
H2O
0.68
1.4
2.7
3.4
4.1
5.5
30%Arcylamide
0.17
0.33
0.67
0.83
1.0
1.3
1.0MTris-HCL(PH8.8)
0.13
0.25
0.5
0.63
0.75
1.0
10%SDS
0.01
0.02
0.04
0.05
0.06
0.08
10%APS
0.01
0.02
0.04
0.05
0.06
0.08
TEMED
0.001
0.002
0.004
0.005
0.006
0.008
4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。
(二)、电泳
准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品、
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