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生化实验报告实验
实验一考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的含量（p24）
一、目的要求掌握考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）
法测定蛋白质含量原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝
法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质─染料结合的原理，定量
的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测
定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广
泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考
马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质
通过范德华键结合后，变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质
结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变
为595nm。且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，通
过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的
量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别
是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色
法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高
四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与
染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更
高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry
法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完
成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白
质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1
小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳
定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控
制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、
Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA
等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋
白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮
蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标
准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面
的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰
物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）
等。三、材料、试剂与器具（一）、试剂：1、考马斯
亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙
醇，加入100ml85%H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,
滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝
G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、
标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定
氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成
100ug/ml蛋白溶液。（二）标准和待测蛋白质溶液1．标
准蛋白质溶液纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法
测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成
100ug/ml蛋白溶液。2．待测蛋白质溶液。人血清，使用
前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。（二）、器材：1、试
管1.5×15cm（×6）和试管架。2、移液管管0.5mL（×2）；
1mL（×2）；5mL（×1）；3、可见光分光光度计。（三）、
标准曲线制作：2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量
为横坐标（），在坐标轴上绘制标准曲线。1）利用标准
曲线查出回归方程。2）用公式计算回归方程。一般相关
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