多聚酶链式反应扩增DNA片段(人教版选修)课件.pptVIP

专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断

一、基础知识1、DNA分子的组成成分和结构DNA分子的基本组成单位是脱氧核甘酸4.共有种,每个基本单位是由一分子的、一分子的碱基、磷酸和一分子的构成。脱氧核糖那么DNA分子的平面结构怎样呢？

2.DNA分子的平面结构5端3端识别：DNA分子的3′端与5′端-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。TACGATGC氢键3端5端

总结：胞内DNA复制的基本体系参与的组分解旋酶在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸引物

㈢.PCR(多聚酶链式反应）1.定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2.DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。3.DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

4.PCR原理⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

5.TaqDNA聚合酶的应用高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。6.需要为PCR反应提供的物质缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。7.PCR技术的特点：PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。

3、DNA分子的热变性原理：变性（加热80-100℃）DNA双链单链复性（缓慢冷却）变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合

PCR的反应过程每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

二、PCR的反应过程3/5/变性95Co3/5/复性3/5/55Co3/5/引物Ⅰ35//5/延伸72o3/C引物Ⅱ

引物15?5?5?引物25?模板DNA第一次复制5?5?5?5?第二次复制5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。

三、PCR反应的实验操作设备及用具1、PCR仪实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

㈡.实验操作步骤1.准备按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。2.移液用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。3.混合混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。4.离心⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。

蒸馏水做对照四、结果分析与评价50倍DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（公式见P63）波长260nm处读数

四、课题成果评价（一）理论上DNA扩增数目的计算1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2（二）实验中DNA含量的测定1、原理n可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关

2、过程①稀释2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零③测定并计算取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数

50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50?g/ml的

体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细加热到94C,双链全o胞提