流式细胞术样本制备.docx

样本制备实例:

细胞表面蛋白荧光染色(ImmunofluorescenceStaining

原理:

对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF和间接染色(IIF两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题,多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白;如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了405nm的激光激发的新型染料如BV421、BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。

材料:

?被检测细胞

?FACSLysingSolution(细胞裂解液,1倍或10倍,10倍的要先稀释到1倍后使

用

?相应的蛋白荧光染色抗体(e.g.CD4FITC,CD8PE,CD3APC

步骤:

在100μL外周血加入抗体:

同型对照:PB100μL+IsotopeFITC20μL+IsotopePE20μL+IsotopeAPC5μL

单阳管:PB100μL+CD4FITC20μL+IsotopePE20μL+IsotopeAPC5μL

单阳管:PB100μL+IsotopeFITC20μL+CD8PE20μL+IsotopeAPC5μL

单阳管:PB100μL+IsotopeFITC20μL+IsotopePE20μL+CD3APC5μL

样品管:PB100μL+CD4FITC20μL+CD8PE20μL+CD3APC5μL

避光15min

在每管中加入2mL裂解液,室温下避光孵育10min

将裂解好的外周血离心1200rpm,5min,去上清液

加入2mL鞘液,混匀

离心1200rpm,5min,去上清液

加入500μL鞘液,混匀

3小时内上机(如果不能立刻上机,2? C-8? C避光保存样本对照:

同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3

单阳CD4加IsotopePEAPC

单阳CD8加IsotopeFITCAPC

单阳CD3加IsotopeFITCPE

细胞周期(CellCycle

原理:

细胞在有丝分裂的过程中,核内的DNA会进行复制,造成DNA含量的波动。如果把处于G0/1期的细胞的DNA含量看做1倍的话,处于G2/M期的细胞的DNA含量则为2倍。荧光染料propidiumiodide(PI是一种核染料。因为每一个PI分子只能插在两组相邻的碱基对中,所以PI染料的荧光强度与被染的DNA的数量成正

比。根据PI的这种特性,我们常常用它来揭示细胞内DNA倍性的关系,从而推导出细胞所处的周期。

然而,流式细胞术只能检测在某一时刻穿过激光的细胞的荧光强度,但无法直接判断在这一时刻到底穿过了几个细胞。如果有细胞粘在一起或是正巧同时穿过激光,流式细胞仪则会读取其整个荧光强度,从而导致对单个细胞DNA含量测定上的误差。为了解决这个问题,我们常常做一张以FL2-W和FL2-A分别为横纵坐标的散点图。FL2-W指的是第二通道(PI里该细胞通过时的时间,而FL2-A指的是第二通道里该细胞的总荧光强度。当细胞粘联时,期总体积与质量变大,导致通过激光时间变长,所以FL2-W的值会比单个细胞大出很多。通过这种方式,我们可以将FL2-W比较统一(小的细胞用门圈出,以排除粘联体,从而确保周期分析的准确性(如下图所示。然后我们就可以在FL2-A的直方图上直观地对细胞倍性进行分析了。

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