SZDBZ 268-2017 动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法.docxVIP

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SZDB/Z

深圳市标准化指导性技术文件SZDB/Z268—2017

动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法

Real-timePCRmethodfordetectionofcattle,buffaloandyak-derivedingredientsinanimalproductsandfeeds

2017-09-12发布2017-10-01实施

深圳市市场监督管理局发布

I

SZDB/Z268—2017

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5原理 2

6仪器、材料与试剂 2

7样品制备 3

8核酸提取 3

9实时荧光PCR检测 4

10结果分析与判定表述 5

附录A(规范性附录)相关试剂配制 7

附录B(资料性附录)实时荧光PCR反应体系配制 9

附录C(资料性附录)黄牛、水牛和牦牛扩增靶标参考序列 11

II

SZDB/Z268—2017

前言

本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本文件的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。

本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。

本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心、中国检验检疫科学研究院。

本文件主要起草人：曾少灵、叶奕优、花群义、谢丽琪、唐金明、阮周曦、吴绍精、曹琛福、林彦星、侯乐锡、孙洁、廖立珊、王勤。

1

SZDB/Z268—2017

动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样标准

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

实时荧光PCRrealtimePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

COX1：细胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochromecoxidasesubunitⅠ)DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline）

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SZDB/Z268—2017

TE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠盐溶液[Tris-EDTA，Tris(hydroxymethyl)aminomethane-eathylenediaminetetraaceticacid]

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）

HEX：六氯-6-甲基荧光素（hexachlorofluorescein）CY5：5氢-吲哚菁染料（CyDye5）

BHQ：黑洞淬灭基团（blackholequenchers）

5原理

样品经研磨混匀后，提取DNA，以DNA为模板，同时采用黄牛和牦牛线粒体细胞色素b基因特异性检测引物和探针、水牛线粒体coxⅠ基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，

判断样品中是否存在黄牛、水牛和牦牛源性成分。

6仪器、材