动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程.docVIP

NNY/TXXXXX—2021

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中华人民共和国FORMTEXT农业行业标准

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动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定

技术规程

TechnicalcodeofpracticeforisolationandidentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisfromanimals

（送审稿）

FORMTEXTXXFORMTEXTXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXFORMTEXTXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT中华人民共和国农业农村部???发布

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。

本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口。

本文件起草单位：西北农林科技大学、中国兽医药品监察所。

本文件主要起草人：杨增岐、王娟、王斌、程敏、赵光明、张纯萍、魏宇辰、王晨骁、赵琪、王鹤佳、徐士新、李霆、崔明全。

动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程

1范围

本文件确立了伪结核棒状杆菌（Corynebacteriumpseudotuberculosis）分离与鉴定的程序，规定了样品采集与保存运输、分离与纯化、筛查与鉴定、菌株保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相应的试验方法。

本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物脓肿样品中伪结核棒状杆菌的分离与鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

NY/T4141动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂或材料

4.1要求

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水，培养基按附录A配制或用商品化产品。

4.2试剂

4.2.1氯化钠。

4.2.2过氧化氢(30%)。

4.2.3聚合酶链式反应预混液（2×PCRMasterMix）。

4.2.4琼脂糖。

4.2.5乙醇：色谱纯。

4.2.6甲酸：色谱纯。

4.2.7乙腈：色谱纯。

4.2.8α-氰-4-羟基肉硅酸（HCCA）：色谱纯。

4.2.9甘油。

4.3溶液制备

4.3.13%过氧化氢溶液：取过氧化氢100mL、水900mL，混匀。

4.3.2基质溶液：取HCCA，按说明书配制；或用市售商品。

4.3.3灭菌甘油：取甘油适量，121℃灭菌20min。

4.3.4无菌生理盐水：取氯化钠8.5g，溶于1000mL水中，121℃高压灭菌20min。

4.3.55%蔗糖脱脂乳保护剂：按照附录A中A.1的规定执行。

4.3.675%乙醇：取乙醇75mL，加水至100mL。

4.3.770%甲酸：取甲酸70mL，加水至100mL。

4.4培养基制备

4.4.1绵羊血琼脂（5%～10%）：按照附录A中A.2的规定执行。

4.4.2脑心浸出液（BHI）培养基：按照A.3的规定执行。

4.4.3小牛血清BHI琼脂（5%～10%）：按照A.4的规定执行。

4.5标准菌株

伪结核棒状杆菌（Corynebacteriumpseudotuberculosis）[ATCC19410/CVCC1186]。

4.6材料

4.6.1革兰氏染色剂。

4.6.2菌种冷冻保存管或磁珠保存管。

4.6.3细菌DNA提取试剂盒。

4.6.4棒状杆菌鉴定卡(盒)或同类产品。

5仪器设备

5.1二级生物安全柜。

5.2冰箱：2℃~8℃，-20℃及以下。

5.3恒温培养箱。

5.4显微镜:10Χ~1000Χ。

5.5PCR仪。

5.6核酸电泳仪。

5.7电泳凝胶成像分析系统。

5.8分析天平：感量0.01g。