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耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药机制及MALDI-TOF在碳青霉烯

酶快速检测中的应用研究

目的:研究不同人群分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）的耐药谱、

CRE菌株对碳青霉烯类药物的耐药机制及其对磷霉素耐药的主要机制,应用

MALDI-TOF建立产碳青霉烯酶菌株的快速检测方法,为临床的合理用药及医院感

染的防控提供帮助。方法:1.收集我院2015年1月-2017年12月临床分离的CRE

菌株,使用全自动微生物分析系统进行常规药物的体外药敏实验,用纸片扩散法

（K-B）检测头孢哌酮/舒巴坦和替加环素、琼脂稀释法检测磷霉素的体外药敏实

验。

2.对227株CRE（其中166株肺炎克雷伯菌,29株大肠埃希菌,32株阴沟肠

杆菌）进行PCR扩增耐药基因（包括碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、AmpC基因及

fos基因）和改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）和EDTA抑制的碳青霉烯酶灭活

试验（eCIM）。用脉冲场凝胶电泳试验（PFGE）检测CRKP菌株的DNA指纹图谱,

分析菌株的同源性。

3.对fos基因阳性菌株进行质粒接合转移实验。对fos基因阴性的磷霉素耐

药菌株进行碳源生长试验、用PCR扩增和测序技术对靶酶基因、转运体相关基因

进行检测和比对分析;4.收集我院2018年1月-2018年6月临床分离的74株CSKP

和前面收集的102株CPKP做质谱仪自建模型,利用MALDI-TOF质谱仪和

ClinProTools3.0软件建立CPKP和CSKP的筛选模型,用于临床产酶菌株的快速

筛查;5.将CPKP菌株分别与不同浓度的亚胺培南和美罗培南共孵育,用

MALDI-TOF检测不同时间段内菌株对底物水解情况,摸索最佳条件。

结果:1.我院三年间共检出272株CRE,主要分离自痰液,其中成人组标本类

型前三位的是痰液、尿液和血液（分别占62.96%、20.83%和6.94%）,儿童组前

三位则是痰液、血液和尿液（分别占50.00%、30.36%和10.71%）;成人CRE菌株

主要来源于ICU（占40.82%）和神经外科（占13.43%）),儿童CRE菌株则主要

来源于新生儿科（占30.35%）和呼吸内科（占17.86%）。CRE菌株对单环内酰胺

类、头孢菌素类、β-内酰胺酶抑制剂复合物等抗菌药物均表现出高度耐药性,

但成人组和儿童组对于氟喹诺酮类药物和氨基糖苷类药物的耐药率存在显著性

差异,成人组耐药率基本在60%以上（仅阿米卡星为40.8%）,儿童组基本在40%

以下。

2.227株CRE菌株中mCIM实验阳性193株,阳性率85.0%,其中eCIM实验阳

性率30.4%;碳青霉烯酶基因的阳性率为83.7%（190/227）,其中146株携带

blasubKPC-2/sub,47株携带blasubNDM-1/sub,43株携带

blasubIMP-4/sub,有14.5%的菌株同时携带两种碳青霉烯酶基因;87.2%的

菌株携带ESBLs基因,以blasubTEM/sub,blasubSHV/sub和

blasubCTX-M-14/sub为主;11.0%的菌株携带AmpC酶基因;共有76.2%的菌株

同时携带碳青霉烯酶基因及其他耐药基因（ESBLs,AmpC酶基因）。部分菌株的

PFGE电泳和同源性结果分析显示菌株间亲缘距离在0.8以下,亲缘关系较远,同

源性较低。

3.227株CRE中有86株磷霉素耐药,耐药率37.9%,其中成人组75株耐药（耐

药率41.2%）,儿童组11株（耐药率18.9%）;86株磷霉素耐药株中75株检出fos

基因（均为fosA3）,其中25株质粒结合成功,表明fosA3基因可通过可移动元

件水平传播;11株（2株阴沟肠杆菌,9株肺炎克雷伯菌）未检测出fos基因;4.11

株fos基因阴性菌株的磷酸己糖转运系统（UhpT）功能正常。2株肺炎克雷伯菌

的甘油-3-磷酸转运系统（GlpT）功能正常,其余9株GlpT系统可能存在功能障

碍。

2株阴沟肠杆菌均未扩增出MurA靶酶基因;9株肺炎克雷伯菌中有6株MurA

序列无突变,1株MurA序列存在单核苷酸插入,导致移码突变,提前终