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生物化学实验

生物化学实验

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实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量

【实验目的】

学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。【实验材料、仪器及试剂】

1．材料：新鲜的植物材料

2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml（2）考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】

1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。

2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。

表1-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表

试剂标准蛋白质溶液（ml）样品提取液（ml）蒸馏水量（ml）G-250试剂（ml）蛋白质含量（ug）595nm吸光值

将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。【结果计算】

C×VT

样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝

VS×WF×1000

式中：C为查标准曲线值（ug）；VT为提取液总体积（ml）；

管号1001.05020.200.852030.400.654040.600.456050.800.258061.0005100700.20.85x800.20.85xVS为测定时加样量（ml）；WF为样品鲜重（g）。

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实验二植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）

免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linkedImmunosorbentAssays,简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA,GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。

直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。

间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP

其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。

材料、试剂及设备

1材料

各种新鲜植物材料2仪器设备

研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。3试剂

(1)磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4?12H2O，用量筒加1000ml蒸馏水，pH为7.5。

(2)样品稀释液：500mlPBS中加0.5mlTween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。

(3)底物缓冲液：称取5.10gC6H8O7?H2O（柠檬酸），18.43gNa2HPO4?12H2O，用量筒加1000ml蒸馏水，再加1mlTween-20，pH为5.0。

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