生物化学--电泳.pptxVIP

电泳

Electrophoresis;

一、定义

;;二、电泳分析技术发展概况

;三、电泳分析技术的分类

;3.根据电泳中是否使用支持物

自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。

区带电泳—使用支持物

(1)按支持物的物理性状不同，可分为

①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维

②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳

③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳

④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳;(2)按支持物的装置形式不同，可分为

①平板式电泳

②?垂直板式电泳

③垂直柱式电泳;;;;;;;;;4.根据电泳系统pH是否连续

连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳

不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如PAGE、IFE

优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。

;电泳技术的特点:;电泳技术应用;四、电泳的基本原理

;以蛋白质分子为例:

;迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。

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M==

E6?r?

;五、影响电泳速度的因素

;2.离子强度（I）

溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。

I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢;;;;;醋酸纤维薄膜电泳

Celluloseacetatemembraneelectrophoresis，CAME

;一、醋酸纤维素;二、特点;血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点;丽春红S染色扫描法结果

;氨基黑10B染色洗脱法结果;;;;几种疾病的蛋白电泳变化;三、影响醋纤电泳结果的因素

;2.电泳图谱分离不清

;3.?电泳速度慢

;4.?白蛋白区带中间部分不着色，染色不足

;血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

;[原理]CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。

将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极??由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。

电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。

;;;[器材和试剂]

1.器材

（1）醋酸纤维薄膜（8×2mm）

（2）点样器

（3）染色皿，漂洗器，镊子

（4）722型分光光度计

（5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽

2.试剂

（1）巴比妥缓冲液（pH8.6I=0.06）

（2）氨基黑10B染色液

（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O

（4）洗脱液：0.4mol/LNaOH

;[操作]

1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。

2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。

3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。

4．用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。

;5．电泳

（1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。

（2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。;6.染色

电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。

7．漂洗

从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干。;8.定量

（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。

（2）计算

吸光度总和（T）