2025高考生物总复习基因工程的基本工具和基本操作程序.docVIP

第54讲基因工程的基本工具和基本操作程序

课标内容(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。(3)DNA的粗提取与鉴定实验。(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。

考点一重组DNA技术的基本工具

1.基因工程概述

基因工程的理论基础

2.重组DNA技术的基本工具

(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)

①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。

②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

(2)DNA连接酶

①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。

②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。

(3)载体

构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。

已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：

(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。

提示限制性内切核酸酶Ⅰ：

限制性内切核酸酶Ⅱ：

(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。

提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。

限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。

1.限制酶的选择原则

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。

(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。

(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。

2.标记基因的作用

标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：

考向结合基因工程的基本工具，考查科学探究

1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接

B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接

C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接

答案C

解析酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。

2.(2024·广东珠海调研)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是()

A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶

B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌

C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色

D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养

答案B

解析分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于感受态，B正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。

3.(2021·全国乙卷