蛋白质的表征.ppt

第十二节突变点的分析天然人白细胞介素—2(IL-2)由133个氨基酸组成，其中有一个游离半胱氨酸(Cys，位于第125位)，第58位和第105位的半胱氨酸形成二硫键，此二硫键为活性所必需，而二硫键的错配对，可降低其生物活性和形成抗原性。用蛋白质工程方法将IL-2的125位Cys改为丝氨酸(Ser)或丙氨酸()da)，其热稳定性等方面都有较明显的改善。为了鉴定新型IL-2的生物工程突变点，教材作者将IL-2用N—对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮—胰蛋白酶(TPCK—胰蛋白酶)水解后，进行了RP-HPLC分析分离。为了搜寻点突变所在肽段，可以用下述方法进行：第31页,共34页，星期六，2024年，5月①天然IL-2和新型IL-2的酶解图谱比较法，寻找有差别的肽进行顺序分析。②荧光标记Cys残基，比较标记前后新型IL-2酶解图谱的差别，从而鉴别出点突变的肽。③用同位素标记法。④由于IL-2只有一个色氨酸残基，而蛋白质的280nm紫外吸收主要是色氨酸，其次是酪氨酸和苯丙氨酸的贡献。所以，我们采用酶解后分别于214nm和280nm处检测肽谱，在280nm肽谱中，光吸收特高的峰就应该是含有色氨酸(Trp)的肽段(残基121～133)，可以简便地作出判断。分离到的肽段再经过毛细管电泳(CE)鉴定确定为均一，最后进行了该肽的氨基酸序列分析。从而由蛋白质化学分析方法直接证明了在新型IL-2中Serl25确实取代了天然IL-2中的Cys。第32页,共34页，星期六，2024年，5月另外，现在可以使用下列的方法鉴定蛋白的突变点。⑤进一步，受到HPLC—二阶微分光谱分析的启发，也建立了这种技术并用于重组蛋白质的C端分析。⑥最近，我们建立了CE—MS联用技术用于蛋白质突变点的分析中，将整个分析水平又提高到一个新阶段。⑦液—质联用已普遍用在重组蛋白的鉴定中。第33页,共34页，星期六，2024年，5月*感谢大家观看第34页,共34页，星期六，2024年，5月关于蛋白质的表征第一节蛋白质结构的基本概念蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为“Protein‘’，该词从希腊文转化而来，意思是“最原始的”，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当的基础。蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是20种α—氨基酸通过酰胺键(肽键)联成的长链分子，这种长链即所谓的肽链。许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为配基或辅基。作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有20种，它们的名称和结构列在表1.1中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。第2页,共34页，星期六，2024年，5月除了列出的20种基本氨基酸外，实际上还有几百种不常见的氨基酸参与某些蛋白质的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨酸和甲基赖氨酸、丁—羧基谷氨酸等，但它们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此不计入基本氨基酸之列。第3页,共34页，星期六，2024年，5月这是一个链状的结构，经水解后，将肽键断裂，转变成一系列的氨基酸。链中相当于氨基酸的单元结构称为残基。而上述链称为肽链。肽链的氨基一端称为N端或氨基端，羧基一端称为C端或羧基端。习惯上将N端列在左边，C端列在右边。第4页,共34页，星期六，2024年，5月从氨基酸的结构看，半胱氨酸的侧链上有巯基(一SH)。巯基的稳定性较差，在碱性pH下易氧化成二硫键。如果一条肽链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，肽链形成链内二硫键。假如两条肽链间形成二硫键，就出现由两条肽链组成的蛋白质(如胰岛素)。蛋白质分子有两对以上的二硫键，或者是蛋白质分子有一对二硫键和一个半胱氨酸，二硫键可能有不同的连接方式，于是出现了异构体。异构体的数目因半胱氨酸含量不同而异，但是在天然的蛋白质分子中没有这种异构体，只有一种连接方式。而在重组蛋白质的复性中，可能出现二硫键的错配对。第5页,共34页，星期六，2024年，5月一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构的重要内容。蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，pH、温度、溶剂极性等环境因素可以影响单元的变化。具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，如