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合成多肽药物杂质分类及产生机制

1、引言

多肽是由多个氨基酸（2≤N≤50）通过酰胺键连接形成的一类化合物，其分子大小介于小分子化药和大分子生物药之间。与小分子化药相比，多肽具有更高的功效、选择性和特异性以及更低的代谢毒性；与大分子生物药比，多肽具有更低的免疫原性，能更深入的渗透到目标组织，且连续生产成本更低。基于这些独特的优势，近年来，多肽类药物越来越受到关注，据统计，肽药物市场的增长速度是其他药物的两倍，目前已有上千种肽类药物进入市场，用于治疗糖尿病、骨质疏松症、癌症、多发性硬化症、慢性疼痛、HIV感染等多种疾病。在多肽药物兴起的初期，由于多肽药物的特殊性，针对多肽药物的指导原则并不多，且对多肽性质的了解也不够深入。随着多肽药物数量的增加和对多肽性质理解的不断加深，针对多肽的指导原则也在不断地更新和扩充，美国和欧洲药典中均有多个关于合成多肽原料药质量控制的相关章节，2022年9月EMA发布了“关于制定合成肽和合成寡核苷酸研发生产指南”的概念文件，我国SFDA也于今年更新了《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则》，这些指导原则为我们进行多肽类药物研发提供了重要的参考和指引。我们知道，活性肽是产生药效的物质基础，因此在肽药物的开发过程中，对活性肽（API）进行质量控制是十分重要的，而肽相关杂质的控制又是质量控制的重要工作，杂质不仅影响用于临床试验样品的质量和安全性，在药物发现的早期阶段，这些杂质还可能影响药效的判断，杂质研究不到位甚至可能导致错误的结论。由于在国内外批准的治疗肽药物中合成多肽占多数（大于70%），因此今天主要探讨的是合成多肽的相关杂质以及可能的产生途径，以期对包装、储存条件选择及制剂处方开发提供一定的指导。2、杂质分类及产生途径

2.1合成过程相关杂质

化学合成技术是多肽生产的金标准，该工艺最初在溶液中进行，后来引入了固相肽合成，固相肽合成一经问世就受到研发者的偏爱，几十年来不断发展与成熟，已稳坐化学合成的第一把交椅。化学合成多肽的步骤包括：挂树脂-去保护基-活化和交联-肽切割。在这个过程中去保护基和活化与交联的步骤容易产生杂质，通常是需要质控的点。

图1固相合成流程简图及相关杂质的产生途径

1缺失肽

顾名思义，缺失肽即是缺失一个或多个所需氨基酸的多肽，不完全去除氨基酸的瞬时保护集团、即将结合的氨基酸活化不足或交联效率低都会导致缺失肽的产生。缺失肽的鉴定方法，即质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差为所缺失氨基酸分子量减去水。例如，某合成多肽药物A目标分子量为1311.5，在样品中检测出分子量1103.5的杂质，与母肽分子量相差208，初步推测至少缺失2个氨基酸，经过推算当缺失脯氨酸（分子量：115）及5-氧代脯氨酸（分子量：129）时所得杂质分子量=1311.5-115+18-129+18=1103.5，与所检测到的该杂质质荷比相符合。图2某合成多肽药物A的质谱图图3某合成多肽药物A缺失肽的质谱图

2插入肽

在合成多肽交联过程中通常会将氨基酸过量投料，如果过量的氨基酸未被充分洗涤或者反应时间过长会将氨基酸再次交联，产生插入肽。对于插入肽的鉴定方法，即质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差为所插入氨基酸分子量减去水。例如：上述某合成多肽药物A目标分子量为1311.5，在样品中检测出分子量1474.9的杂质，与母肽分子量相差163.4，初步推测插入酪氨酸，酪氨酸分子量为181，杂质分子量=1311.5+181-18=1474.5，与所检测到的该杂质质荷比相符合。图4某合成多肽药物A插入肽的质谱图

3错结肽

当固相反应过程中既发生氨基酸缺失又发生氨基酸插入时就会产生错结肽。

4共价附着肽杂质

在固相合成完成后永久性保护基团不完全去除将导致保护基共价附着在肽序列中，产生共价附着肽杂质。对于这类杂质的鉴定方法，如果质谱中杂质分子量与目标肽分子量相差56Da，那么附着的保护基为tBu保护基，如果质谱中杂质分子量与目标肽分子量相差100Da，那么附着的保护基为tBoc-TCS保护基。

2.2降解相关杂质

降解相关杂质包括制造过程中通过降解机制形成的杂质和储存过程中通过降解机制形成的杂质。引起多肽不稳定的因素包括氧化、光照、高温、pH、离子强度变化及吸附等，肽链中氨基酸种类及氨基酸所在的位置对多肽的稳定性有重要影响。因稳定性而产生的肽杂质包括：

1差向肽

差向肽是指序列中含有1个或多个非预期手性构型的氨基酸残基所形成的杂质，其产生可能源于起始物料中的光学异构体，也可能是合成过程中氨基酸手性中心烯醇化或氮杂内酯化形成。差向肽杂质的色谱行为与主成分非常接近，分子量也与主成分一样，仅此分离和鉴定难度较大。可采用氘代试剂对多肽进行水解并衍生化处理，通过水解所得氨基酸的手性异构体的含量判断肽链中易发生消旋的氨基酸，通过定向制备可能