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实验四RNA的提取及其纯度检测

实验目的：了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及

电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理

Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。

在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。

吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容

材料小鼠新鲜肝

试剂

总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇；

电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10mMEDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青），

琼脂糖。

操作步骤

总RNA的提取

1小鼠肝组织的匀浆裂解

断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反

复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。按1mlTrizol加入0.2ml氯仿，震荡15秒，室温放置

3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。

2RNA的沉淀

将离心的上清转移到新的离心管中，按1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室

温放置10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。

3RNA的洗涤与溶解

吸掉上清，加入1ml75%乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。吸掉上清，空气

干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水（50μl）溶解RNA，立即电泳和紫外浓

度和纯度鉴定，剩余-70℃保存备用。

结果

在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S

和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮

度的2背左右，说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度

总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A和A值，根

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据1OD=40ug定量,并计算A/A比值，每一样品重复3次。

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如果A/A比值均在2.0以上（2.0－2.2之间），说明RNA的纯度很好。

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注意事项

创造无Rnase的环境

注意以下几点，以防止Rnase污染样品，保证分离到全长mRNA：

1、手和空气中的细菌霉菌是主要的Rnase污染源。为防止污染，应在超净台上无菌操作。

这些试剂都要反复使用，所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。

2、最好用一次性使用塑料制品提RNA，这些制品常是无RNase的，无须灭活RNase。

3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前应除RNase。玻璃制品应于200℃烘烤过夜，

塑料制品用前用0.1NNaOH，1mMEDTA作彻底冲洗，再用无RNase水冲洗。

4、用户自备的溶液应用0.05%DEPC处理过夜，再高压灭菌30分钟以出去痕量DEPC。

实验五逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段

实验目的了解RT-PCR的原理，掌握RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。

实验原理

PCR（PolymeraseChainReaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有

效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的

作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已

广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA，mRNA