植物组织培养的基本方法(“培养”相关文档)共32张.pptxVIP

植物组织培养的基本方法;（优选）植物组织培养的基本方法;灭菌;灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。

消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。

而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。;常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。

物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。

化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。

这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。;1．培养基用湿热灭菌

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序

按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。;2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌

在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。通常采用170℃持续90分钟来灭菌。

4.不耐热的物质采用过滤灭菌

一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。

;5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌

（1）紫外线灭菌

在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不??过1.2米为宜。

（2）熏蒸灭菌

用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛。

;6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌

物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。

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7.植物材料表面用消毒剂灭菌

外植体的选择:

外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；

取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；

器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；

外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。;外植体的灭菌方法:

植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。

首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。

第三步是用灭菌剂处理。

最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。;常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。

;接种;接种前后的程序：

A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；

B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手；

C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。

D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。

E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。;C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。

1、污染：是指在组织培养过程中由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。

外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；

5、培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

紫外线