第五章蛋白质的化学修饰.pptVIP

目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种。;蛋白质化学修饰的应用;第五章蛋白质的化学修饰;第一节蛋白质的化学修饰;1、氨基的化学修饰;蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行;二硫键的还原：巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。

判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。

5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。;温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件

pH值的变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。

温度：影响活性巯基的微环境

有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。;产生二硫键

二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开

DTT、二硫苏糖醇

将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子

;形成肽键

通过酶连接反应形成肽键

从猪胰岛素生产人胰岛素

将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）

通过酶法与活性酯偶联

羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子

;产生非天然型共价键

利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。

可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体

;第二节酶分子的化学修饰

酶的活性中心

酶化学修饰的目的

酶化学修饰的原理

酶化学修饰的设计

酶化学修饰的应用

;一、酶的活??中心（activesite）

（一）活性中心的概念

酶的必需基团(essentialgroup):

与酶活性有关的基团

酶的活性中心(activecenter):

由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.

;酶分子;活性中心的重要化学基团

7种氨基酸出现的频率最高

LysAspGluCysHisTyrSer

（兰天果拌猪肉丝）

某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基

和咪唑基）是酶的必需基团。

赖氨酸的氨基

天冬氨酸和谷氨酸的羧基

半胱氨酸的巯基

组氨酸的咪唑基

酪氨酸和丝氨酸的羟基;;;（二）活性中心的共性;（三）研究酶活性中心的方法

1.物理学方法：

用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。;2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为

1)非专一性化学修饰

用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。

若某基团被修饰后：

酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团

酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团

但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。;;差别标记：

底物或抑制剂存在活性基团不与修饰剂作用

去除底物或抑制剂原来被保护的基团带同位素标记

可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。;2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）

用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。

3)亲和标记（位点专一性修饰）

采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。

作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。;化学修饰的专一性;亲和修饰剂：

①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基

亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸

残基亲和力小。

②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性

中心的基团形成稳定的共价键。

;3.蛋白质工程：

将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。;;2.改变酶特性有两种主要的方法：

1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。

2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。;3.酶化学修饰的概念

酶