聚合酶链式反应.ppt

目录目录关于聚合酶链式反应一、PCR的定义在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。第2页,共27页，星期六，2024年，5月PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第3页,共27页，星期六，2024年，5月KaryB.Mullis（1944－）第4页,共27页，星期六，2024年，5月二、PCR技术的优点特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍第5页,共27页，星期六，2024年，5月三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopied第6页,共27页，星期六，2024年，5月PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。第7页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8页,共27页，星期六，2024年，5月1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第9页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃第10页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物第11页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第12页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始第13页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第14页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第15页,共27页，星期六，2024年，5月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第16页,共27页，星期六，2024年，5月PCRproduct第17页,共27页，星期六，2024年，5月TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle