细胞工程与作物育种.ppt

外植体消毒外植体常用消毒剂的种类、浓度、及效果第31页,共52页，星期六，2024年，5月第32页,共52页，星期六，2024年，5月培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌接种过程消毒接种室（无菌操作室）的灭菌接种台的灭菌工作人员第33页,共52页，星期六，2024年，5月3、培养条件光照：白色荧光灯，光强1000~5000Lx，12~16hr，用自动定时器控制光照时间温度：多为25±2℃湿度：容器内湿度：100%环境湿度：要求70%~80%第34页,共52页，星期六，2024年，5月4、基本过程外植体取材（已分化的器官、组织、细胞等）↓外植体消毒灭菌，接种到相应的脱分化培养基↓（脱分化）愈伤组织或胚状体↓接种到分化培养基↓（再分化）分化芽、根，完整植株↓练苗，移栽大田第35页,共52页，星期六，2024年，5月胚状体愈伤组织第36页,共52页，星期六，2024年，5月水稻花药培养过程第37页,共52页，星期六，2024年，5月第38页,共52页，星期六，2024年，5月影响花药及花粉培养的因素供体植株的基因型培养基（基本培养基、附加物，如水稻、小麦用N6）小孢子发育阶段合适发育期的花药，离体培养才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。供体植株的生理状态及培养前预处理第39页,共52页，星期六，2024年，5月三、原生质体培养与体细胞杂交植物原生质体：除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。原生质体融合：也称体细胞杂交，使不同原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。第40页,共52页，星期六，2024年，5月第41页,共52页，星期六，2024年，5月（一）基本步骤原生质体分离原生质体培养原生质体融合融合体的发育及杂种细胞的筛选体细胞杂种植株的再生及鉴定P254，图15-9第42页,共52页，星期六，2024年，5月（二）原生质体分离分离原生质体的材料叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞。分离植物原生质体所需的酶果胶酶、纤维素酶原生质体分离步骤一步法：果胶酶和纤维素酶混合处理材料二步法：用果胶酶降解细胞间层使细胞分离；再用纤维素酶水解细胞壁释放原生质体。第43页,共52页，星期六，2024年，5月第44页,共52页，星期六，2024年，5月酶解后，用200目筛过滤，滤液再用400目筛过滤，滤液经低速离心，去上清液后，即为纯化原生质体。纯化后的原生质体第45页,共52页，星期六，2024年，5月（三）原生质体培养液体浅层培养固、液培养固体包埋培养注意几点：原生质体培养之前必须调到一定的密度（细胞密度），一般以103－105（104－108）个细胞/ml。密度太低原生质体不能分裂。在培养过程中，根据细胞生长情况不断降低渗透压，以促进分裂。第46页,共52页，星期六，2024年，5月一般在暗条件下培养直到愈伤组织形成。暗条件有利于细胞壁形成和细胞再生。愈伤组织形成后，可转移到普通培养基上进行细胞繁殖和分化。培养效果可用植板率来衡量。植板率：每个平板接种细胞总数中形成愈伤的百分率。即：每平板愈伤数/每平板接种的细胞总数×100%。每平板接种的细胞总数=每ml培养液中细胞数×该平板细胞培养液ml数。第47页,共52页，星期六，2024年，5月（四）原生质体融合1、融合过程异种原生质体发生膜接触→形成细胞质桥→两种细胞质将两个核包围，完成融合。2、融合体类型对称杂种：综合双亲全部遗传物质的融合体非对称杂种：部分遗传物质发生丢失的融合体胞质杂种：双亲胞质+单亲细胞核非杂种：单亲的原生质体融合。第48页,共52页，星期六，2024年，5月3、融合方法原生质体不带电荷，它们相互排斥，需通过诱发才能发生融合。（1）NaNO3处理：最早使用的融合诱发剂。融合频率低，对叶肉（高度液胞化）的原生质体有害。（2）高Ca2+（0.05MCaCl2）+高pH(10.5)+高温（37?C）处理：融合速度快，但频率不高。（3）聚乙二醇（PEG）处理：25-50%PEG