流式细胞术原理及应用(共61张课件).pptxVIP

流式细胞术原理(yuánlǐ)及应用;一、什么是流式细胞术？

流式细胞仪的构造

二、怎样设计流式实验？

三、流式实验中涉及(shèjí)到的关键步骤

四、常见流式细胞术应用;一、流式细胞术基本概念;第四页，共61页。;流式细胞仪构造(gòuzào)图;常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；

设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。

细胞功能变化的研究(yánjiū)；

第二十三页，共61页。

单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光(yíngguāng)Median值相等时为最合适的补偿。

富集和分析细菌，藻类，浮游植物等

AfterCompensation

研究对象为生物颗粒，如各种(ɡèzhǒnɡ)细胞、微生物及人工合成微球等。

流式细胞仪检测(jiǎncè)范围

对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。

第二十七页，共61页。;流动(liúdòng)室与液流驱动系统;激光光源与光束成形(chénɡxínɡ)系统;光学系统;信号检测(jiǎncè)与分析系统;;阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小(wēixiǎo)的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。

FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。;荧光信号

细胞自发荧光

特异荧光素标记激发的荧光信号

荧光信号的线性测量和对数(duìshù)测量---光电倍增管

1）检测光子，转换成电信号

2）将电信号等比例的放大

荧光信号的面积、宽度和高度;由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式(fāngshì)。

一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。;直方图（DistributionHistogram）

横坐标：道数

纵坐标：细胞(xìbāo)数;细胞(xìbāo)分选系统;第十七页，共61页。;二、荧光(yíngguāng)素;激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光

发射光谱：某一波长激发光引起(yǐnqǐ)荧光素发射的荧光;常用(chánɡyònɡ)荧光素;常用荧光(yíngguāng)染料;三、如何(rúhé)设计流式实验;A、根据机器配置选择荧光素

多色标记(biāojì)荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。;B、根据抗原表达强弱合理(hélǐ)分配荧光素;高表达(biǎodá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达(biǎodá)低的抗原：

CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE;尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7；

选择不同(bùtónɡ)激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；;D、尽量避免偶联染料(rǎnliào)使用带来的假阳性;3）流式试验对照(duìzhào)设置;流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子(diànzǐ)信号越强；电压越小，信号越弱。

通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。;同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型

（Fc段相同，F（ab’）2段不同）

与染色的单克隆抗体：

①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型

③相同荧光素标记④相同剂量(jìliàng)和浓度

⑤但由未免疫动物血清纯化而来

用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色;第四十九页，共61页。

第二十七页，共61页。

单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光(yíngguāng)Median值相等时为最合适的补偿。

门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程(guòchéng)实际上就是选门和设门的过程(guòchéng)。

第三十九页，共61页。

细胞功能变化的研究(yánjiū)；

PE-MediannegPE-Medianpos

凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于(yóuyú)DNA的降解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在G1峰前出现亚二倍体峰，即亚G1峰(凋亡峰)。

凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于(yóuyú)DNA的降解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下降，荧光强度