免疫组织化学检验技术（免疫学检验课件）.pptx

酶免疫组织化学检验技术;酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。;一、标本制作;二、酶标记抗体的免疫组化染色法;（二）技术类型

1.直接法

形成抗原一抗体一酶复合物

2.间接法

形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物

3.酶标抗体三步染色法为间接法的改良法

形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物

（三）方法评价;三、非标记抗体酶免疫组化染色法;（二）技术类型

1.酶桥法

用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色;;2.PAP法

即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶（P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。

通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP;;;3.双桥PAP法

该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。

4.APAAP法

APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。

;（三）方法评价

该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。;四、临床应用;亲和组织化学检验技术;亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌A??白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。

用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、SPA与IgG、链霉亲和素与生物素等。;一、生物素-亲和素法;常用的技术类型有：

1.标记亲和素-生物素法（LAB法）

将亲和素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。;;2.桥连亲和素-生物素法（BAB法）

先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。;;3.亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法（ABC法）

此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。;;二、SPA法;;三、链霉亲和素—生物素技术;