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钙池调控钙内流参与丁酸钠诱导结肠癌细胞凋亡过程

背景结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,国际流行病学资料显示,结肠癌的发

病率在恶性肿瘤发病率中居第3位,死亡率中居第4位,2008年有1,233,700新

发病例和608,700死亡病例,具有发病率高、死亡率高、治愈率低等特点。尽管

近年来射靶治疗药物(如西妥昔单抗和贝伐单抗)的出现和其他治疗方法的改进,

但结肠癌的预后仍不能令人满意。

因此,探寻结肠癌的预防和治疗药物就显得尤为重要。短链脂肪酸主要包括

乙酸、丙酸和丁酸,是肠道微生物发酵膳食纤维产生的主要代谢产物,可抑制结肠

癌、乳腺癌和淋巴瘤等多种肿瘤细胞的增殖、并促进其凋亡和分化,其中丁酸的

作用最为显著,但其作用机制尚不清楚。

有研究显示,丁酸钠(sodiumbutyrate,NaB)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制

剂(histonedeacetylaseinhibit,HDACi),可通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性,

发挥其各种功能。体内外试验表明,多种HDACi具有低毒强抗癌作用以及肿瘤细

胞高度选择性等特点。

为此,HDACi是近年来抗肿瘤药物研究领域中的热点之一。目前已有多种

HDACi,如辛二酰苯胺异羟肟酸(Suberoylanilidehydroxandcacid,SAHA)、丙

戊酸(valproicacid,VPA)、曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)等已进入恶

性肿瘤临床Ⅰ期和Ⅱ期试验阶段。

2006年,美国FDA批准第一个HDACi药物vorinostat(N-羟基-N’-苯基辛

二酰胺)作为抗肿瘤药物,主要用于治疗顽固复发性、耐药性T细胞淋巴癌,并由

美国Merck公司生产上市。NaB作为一种典型的HDACi,可通过抑制组蛋白去乙酰

化酶活性,引起组蛋白的高度乙酰化,从而上调多种促凋亡蛋白(Bid,Bak,Fas,

FasL,TRAIL,caspase)和/或下调多种抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-XL,XIAP,

survivin,cFLIP)的表达,最后通过线粒体和/或死亡受体途径诱导多种肿瘤细

胞凋亡。

细胞内钙浓度的升高或下降可引起一系列细胞生物学反应,如神经递质分泌、

骨骼肌收缩等快速反应,以及细胞分化、有丝分裂、细胞凋亡等慢速反应。研究

显示,无论是在早期还是晚期细胞内钙浓度的升高都有促细胞凋亡作用。

钙池调控钙内流(store-operatecalciumentry,SOCE)最早被命名为库容

性钙内流(capacitativecalciumentry,CCE),当时认为内质网钙库中钙离子释

放可促发细胞外钙离子通过质膜上的钙通道内流。尽管CCE概念早在1986年就

已经发现,但是构成SOCE的关键分子及其机制直到近几年才逐渐被发现。

一个是基质相互作用分子(stromalinteractionmolecule1,STIM1),STIM1

被认为是钙离子浓度感受器,主要定位在内质网膜上,仅少量定位于细胞膜；另一

个是通道蛋白-Orail,Orail主要定位于细胞膜。内质网钙库中钙离子清空后可

引起内质网膜上散在分布的STIM1发生寡聚化并发生移位,靠近细胞膜,进而引

起细胞膜上的Orail通道由散在分布形成离散的斑点状分布,通道功能被激活,

细胞外钙离子内流。

研究表明,通过SOCE的细胞外钙内流参与多种重要的生理功能,如细胞分化、

细胞凋亡和细胞增殖等。但SOCE是否在NaB诱导结肠癌细胞凋亡过程中发挥作

用,还未有研究报道。

因此,本研究主要探讨SOCE是否参与NaB诱导结肠癌细胞凋亡过程,为开发

NaB作为肿瘤治疗药物提供理论依据。方法将结肠癌细胞株HCT-116置于37℃培

养箱内培养(5%C02、95%空气),分别用不同浓度的NaB处理HCT-116不同时间后,

流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(poly

ADP-ribosepolymerase,PARP,细胞凋亡标志性分子)的切割片段。

观察细胞内外钙螯合剂(BAPTA-AM和EGTA)、SOCE非特异性阻断剂(2-APB

和SKF96365)以及下调STIM1的表达等预处理对NaB促结肠癌细胞凋亡率及PARP

切割片段的影响。用免疫印迹法和免疫荧光法检测NaB对结肠癌细胞STIM1和

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