mdpub11与mdpub42的基因克隆 与载体构建.docx

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MdPUB11和MdPUB42的克隆与载体构建

CloningandCarrierConstructionofMdPUB11andMdPUB42

中文摘要

从嘎啦组培苗叶片中提取总RNA，并将其反转录成cDNA。根据已知序列设计PCR引物并对其进行修饰，运用PCR技术扩增出苹果MdPUB11与MdPUB42的基因片段，同时完成了MdPUB11与MdPUB42的基因表达载体的构建。文章在全长基因克隆，MdPUB11与MdPUB42基因表达载体的构建方面积累了经验，并为进一步的相对应的基因表达研究奠定了基础，本文将详细论述基因克隆与载体构建的详细过程。

关键词：苹果；cDNA；MdPUB11；MdPUB42；基因克隆；表达载体构建

1前言

基因克隆技术是20世纪70年代发展起来的一项具有性的研究技术，其最终目的在于通过将目的基因导入受体细胞，并将受体细胞内的目的基因大量复制。载体构建技术是运用质粒携带外源基因进入受体细胞并正常翻译与表达。本次试验所克隆的MdPUB11与MdPUB42经过查阅资料发现未有人进行克隆研究，因此此次试验将对于这两种基因进行克隆及载体构建过程进行详细论述，旨在为下一步继续深入研究奠定基础。

材料与方法

试材

嘎啦组培苗由吴老师实验室各位师兄师姐培养。

实验所需酶与试剂

Trizol法提取RNA；北京全式金有限公司的EasyPurePlasmidMiniPrepKit质粒提取试剂盒；反转录酶；DNA聚合酶；限制性内切酶（SmaⅠ；StuⅠ）；胶回收采用康为世纪公司的GelExtractionKit琼脂糖凝胶DNA回收试剂

盒；PCR采用艾科瑞生物公司的EvoM-MLVPluscDNA合成应试剂盒，上海唯地生物技术有限公司的MAXDH5α

ChemicallyCompetentCell重组试剂盒。

RNA的提取

利用Trizol法提取嘎啦枝条形成层细胞中RNA。

第一步是液氮研磨。组织块被切碎放入臼中。加入少量液氮快速研磨。(液氮不仅能防止各种组织成分被破坏和降解，还能使组织变硬、变脆，便于研磨，在超低温条件下阻止细胞内外的一切生物反应，防止RNA酶参与降解反应。)

第二步将50mg/ml的Trizol加入（加入量取决于组织体积，使组织体积不超过Trizol体积的10%），室温静置5分钟，使组织充分裂解。

第三步转入离心管，12000转/分钟条件下离心5分钟，结束离心后弃置沉淀。

第四步按照200微升氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15分钟。（尽量避免使用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂）

第五步4摄氏度条件下使用离心机以12000转/分钟离心15分钟。结束后吸取上层水相移入新离心管中。（不要吸取中间酚相）

第六步按照0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇并混匀，室温放置5-10分钟。

第七步加入与Trizol体积相同的75%乙醇，轻轻振荡离心管，使沉淀悬浮。

第八步，在4摄氏度条件下放入离心机离心5分钟，结束后弃置上清液。

第九步超净台条件下风干5-10分钟。（RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）第十步用50微升水，TEbuffer溶解RNA样品，55-60摄氏度，持续5-10分钟。

第十一步测O.D值定量测定RNA浓度。（此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之间）

2.4设计引物及反转录为cDNA

2.4.1设计引物

第一步在NCBI上搜索找到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下方origin中，复制该编码序列作为查询序列。

第二步用PrimerPremier5搜索引物。

第三步用Oligo验证评估引物。

第四步引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，通常来说，多少会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行比对分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列即可。

4.2将mRNA反转录为cDNA

根据mRNA在3’段有polyA尾巴的特点，用oligo-T作为引物，在20微升体系中，加入1微升mRNA，1微升iligo-T(500微升/毫升)。RNase-Free水，在70摄氏度金属浴条件下培育10分钟立即冰浴冷却，继续加入4微升5×Buffer，2微升0.1MDTT，1微升lOMmdNTPs，混合均匀后转入42摄氏度金属浴条件下保温2分钟，加入1微升反转录酶，然后再

次放入42摄氏度金属浴条件温育50分钟。温育完成后转入70摄氏度条件灭活逆转录酶，持续15分钟，最终得到cDNA。

2.5利用PCR技术扩增基因

2.5.1试剂准备