绿孔雀检疫技术 第4部分：消化道线虫实验室检测技术规范.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

绿孔雀检疫技术第4部分：消化道线虫实验室检测技术规范

1范围

本规范明确了绿孔雀(Pavomuticus）检疫技术中消化道线虫实验室检测技术的试验原理、常见线虫形态特征、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理。

本文件适用于绿孔雀检疫技术中消化道线虫实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

线虫Nematodes

线虫动物门为假体腔动物，线虫属通常呈圆柱形，线状或毛发状，某些种类呈鞭状或球状。不分节，两侧对称并具有三胚层假体腔，一般为雌雄异体。虫体大小随种类不同差别较大，雄虫一般较雌虫为小。寄生性线虫最常见寄生于消化系统。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BLAST：基于局部序列比对算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchToolDNA：脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

NCBI：美国国家生物技术信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformationPCR：聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液TrisAcetate-EDTABuffer

5试验原理

绿孔雀消化道线虫的检测可采用形态学观察线虫虫卵或虫体的方法，当镜检发现形态特征明确的线虫虫卵，如毛细线虫，可直接作出判定；对于无法利用形态学鉴定的虫卵或虫体，进一步采用PCR方法进行虫种鉴定。

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6常见线虫形态特征

绿孔雀常见的线虫主要有蛔虫（Ascaridia）、异刺线虫（Heterakis）和毛细线虫（Capillaria）。绿孔雀线虫的基本形态特征参见附录A。

7试验条件

7.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489中的要求。

7.2人员要求

采样和试验人员为具有相应的专业知识人员。

7.3生物安全要求

采样及试验过程中做好自身防护，试验结束后的检验器具要进行消毒处理，废弃样品要及时进行无害化集中处理。

8仪器设备和试剂

8.1主要仪器设备

8.1.1正置光学显微镜。

8.1.2载玻片及盖玻片若干，漏斗、玻璃棒、烧杯。

8.1.3金属筛：60目。

8.1.4PCR扩增仪。

8.1.5高速台式离心机。

8.1.6电子天平：量程0.01mg～10000mg。

8.1.7恒温水浴锅：36℃±1℃,65℃±1℃。

8.1.8超纯水器，高压灭菌器。

8.1.9单道移液器（量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL）。8.1.10电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像仪、涡旋振荡器。

8.2主要试剂

8.2.1饱和食盐水。

8.2.22.5%重铬酸钾液，乳酸酚透明液。

8.2.3基因组DNA提取试剂盒。

8.2.42×TaqPCRMasterMix酶。

8.2.5DL2000DNAMarker。

8.2.6无菌水。

8.2.750×TAE缓冲液：Tris碱242g和57.1mL冰醋酸，用双蒸水定容到1L。

8.2.8核酸染料，用于凝胶成像显示条带。

8.2.91%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖与100mL1×TAE缓冲液，加热融化均匀，60℃时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。

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9样品

样品从绿孔雀粪便中采集，采样和保存方法见附录B。

10试验步骤

10.1形态学检测

10.1.1虫卵检测

采用饱和食盐水漂浮法，线虫卵富集在饱和液表面。取粪样5g，加饱和食盐水50mL，用玻璃棒搅匀，通过60目金属筛或双层纱布过滤到干净烧杯中，静置0.5h；蘸取表面液膜，点样于载玻片上，盖上盖玻片，进行镜检。

10.1.2虫体检测

从粪样中分离虫体，用生理盐水清洗干净，放于载玻片，滴加乳酸酚透明液2～3滴，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察透明虫体的内部形态构造。对于存疑虫体，结合下述PCR扩增方法对其进行虫种鉴