14 受体菌 本科精品课件.ppt

受体菌受体菌1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性一般基因工程受体菌都是限制－修饰系统缺陷的变异株。受体菌的基因型和表型（1）基因型用3个斜体字母表示，若不同的基因变异导致相同的结果，后面加上一个大写字母：dam,recA(2)表现型用3个正体字母表示，第一个字母大写：Amp+(3)＋：含有该基因【或表现有抗性，活性】(4)－：基因变异【或表现敏感或失活】(5)?：基因（或区段）缺失(6)Ts:温度敏感(7)::：插入符号的说明：基因型变化的功能重组机能缺失对插入DNA具有直接作用因子的缺失抗药性的变异宿主蛋白酶缺失有利于选择转化体的基因停止密码回复有利于点突变的基因菌株筛选基因对插入DNA具有直接作用因子的缺失*有利于选择转化体的基因*DH5α－－克隆菌株*BL21(DE3)－－表达菌株*其他常用菌株TOP10:繁殖快，适于基因克隆ER2566:适于pTXB1质粒表达外源基因一般质粒资料会标明推荐菌株。菌种保存和活化一.甘油菌保存：1、100ul菌液＋100ul灭菌甘油【混匀】2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】3、－20℃可保存半年；【－80℃可长期保存】二、甘油菌活化：1、取一管甘油菌，混匀；2、用接种针接种并在培养平板上划线；3、37℃倒置培养12h；4、挑单克隆于2.5mlLB(视情况加抗生素），37℃振荡培养12h.【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】感受态细胞的原理通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；当用电击法或CaCl2等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。感受态细胞的活性较低，处理需温柔。转化方法——CaCl2法感受态细胞的制备1.菌种活化2.取0.5ml菌液至50mlLB培养液中；3、37℃，振荡培养2h至对数期；4、转至50ml无菌塑料管，0℃*10min;5、5000rpm*10min*4℃6、取沉淀，加25ml50mMCaCl2【0℃，无菌】7、5000rpm*10min*4℃8、取沉淀,加2ml含15％甘油的50mMCaCl2重悬，200ul/tube分装，液氮速冻后至－80℃冰箱保存（半年有效）。【注意：（1）需要做一个无质粒的对照（2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率－－大约106【1ugPUC质粒，产生克隆106】遗传改造后的受体菌应具备的条件限制缺陷型：hsdR-重组缺陷型：recA-、recB-、recC-转化亲和型遗传互补型感染寄生缺陷型/html/ziliao/yixue/9/3c561078b707b404d21cd7469e54df72.htm但也有不同的说法/read/cv3266164/转染（Transfection）、转化（Transformation）以及转导（Transduction）*/html/ziliao/yixue/9/3c561078b707b404d21cd7469e54df72.htm但也有不同的说法/read/cv3266164/转染（Transfection）、转化（Transformation）以及转导（Transduction）*