绿孔雀检疫技术 第2部分：禽流感病毒实验室检测技术规范.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

绿孔雀检疫技术

第2部分：禽流感病毒实验室检测技术规范

重要提示：由于禽流感病毒可感染人类，采样和检测人员应穿戴防护服及口罩，并采取必要的消毒措施。涉及禽流感病毒的实验操作，应在相应的生物安全级别实验室（符合GB19489的要求）进行。本检测技术规范中凡接触病毒样品的检验器材、废弃物及其包装物均应做消毒或灭菌等无害化处理，以免污染环境或扩散病毒。

1范围

本文件规定了绿孔雀（Pavomuticus）检疫技术中禽流感病毒实验室检测技术的总则、禽流感病毒毒株的毒力划分和血清亚型、仪器设备和试剂、样品、试验步骤和试验数据处理。

本文件适用于绿孔雀检疫技术中禽流感病毒实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

禽流感Avianinfluenza

禽流感是由正粘病毒科（Orthomyxoviridae）甲型流感病毒属（InfluenzavirusA）成员引起禽类的一种急性、全身出血性传染病。

3.2

病毒血凝Viralhemagglutination

具有血凝活性的病毒（如流感病毒）粒子，凭借其表面的血凝素识别、结合特定动物红细胞表面受体并使红细胞凝集（即红细胞不再自然下沉汇集）。

3.3

病毒血凝抑制Viralhemagglutinationinhibition

抗体特异性结合于具有血凝活性的病毒粒子的血凝素（H）抗原位点，干扰病毒H蛋白与红细胞受体之间的结合，从而阻断或抑制病毒粒子凝集红细胞的能力。

3.4

反转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreaction

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以RNA（mRNA）为模板，经逆转录酶催化生成cDNA，再以cDNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，常用于获得目的基因或检测mRNA表达。

3.5

成对碱性氨基酸裂解酶Furin

动物细胞产生的内切蛋白酶，能识别、裂解流感病毒血凝素（H）蛋白中存在的R-X-X-R?位点，产生H1和H2两个亚基，以形成具有感染活性的流感病毒粒子。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AIV：禽流感病毒Avianinfluenzavirus

AMV：禽成髓细胞瘤病毒Avianmyeloblastosisvirus

DEPC：焦碳酸二乙酯Diethypyrocarbonate

dNTP：脱氧核苷酸Deoxyribonucleotidetriphosphate

H：血凝素Hemagglutinin

HA：血凝Hemagglutination

HAU：血凝单位Hemagglutinationunit

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacidHI：血凝抑制Hemagglutinationinhibition

HPAI：高致病性禽流感Highlypathogenicavianinfluenza

M：基质蛋白Matrixprotein

MDCK细胞：犬肾传代细胞Madin-Darbykidneycells

N：神经氨酸酶Neuraminidase

PBS：磷酸缓冲盐溶液Phosphate-bufferedsaline

PCR：聚合酶链式反应Polymerasechainreaction

RBCs：红细胞Redbloodcells

RNA：核糖核酸Ribonucleicacid

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreactionSPF：无特定病原体Specificpathogenfree

5总则

5.1鸡胚接种和MDCK细胞培养均是分离禽流感病毒的有效方法，检测流感病毒时，根据具体情况选用其一，或同时采用。

5.2取5.1收获的尿囊液或MDCK细胞培养物上清做HA试验和HI试验，确定分离毒株的种属及血清型（亚型）。

5.3对5.1或5.2分离毒株采用RT-PCR扩增分析其M基因，做出禽流感病毒定性鉴定。

5.4对5.2确定的禽流感病毒H5、H7或H9血清亚型的分离毒株，用血