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基因敲除技术在微生物中的应用

王雪;黄建忠;李力

【期刊名称】《《微生物学杂志》》

【年(卷),期】2019(039)004

【总页数】7页(P100-106)

【关键词】基因敲除技术;微生物;研究进展;成功案例

【作者】王雪;黄建忠;李力

【作者单位】福建师范大学生命科学学院福建福州350108

【正文语种】中文

【中图分类】Q939.9

基因敲除技术，又名基因打靶，自20世纪80年代发展起来，主要建立在同源重

组的基础上，属于一种新型分子生物学技术。经典的基因敲除技术是指通过同源重

组原理将标记基因定点地整合入目标细胞基因组上某一特定的位点，以达到细胞内

某一目的基因敲除的一种技术。基因敲除技术已经广泛应用于动植物、微生物，应

用形式多种多样，主要有同源重组法、随机插入突变法、RNA干扰法、ZFNs法、

TALEs法，此外，还有目前热点研究的CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除技术。

基于同源重组的基因敲除技术主要有RecA系统同源重组法、Red系统同源重组

法、基于自杀载体的同源重组法、基于温敏型质粒的同源重组法。这四种方法各有

优缺点，要根据不同的微生物不同的条件选择不同的方法，其基本原理如图1。基

因敲除技术的热门也使得一大批发明专利涌现。本文对几种广泛应用于微生物的基

因敲除方法进行介绍，并提供一些成功案例及发明专利，各种方法的比较见表1。

图1同源重组法进行基因敲除的一般原理Fig.1Ceneralprinciplesofgene

knockoutbyhomologousrecombination

表1基因敲除方法的比较Table1Comparisonofgeneknockoutmethods方

法来源动力常见质粒特点RecA系统大肠埃希菌功能蛋白-同源臂长,反应条件苛刻,

操作复杂Red系统λ噬菌体功能蛋白pKD46同源序列短,相对简单自杀型载体其

他生存压力pK18mob、pSVP202同源序列较短,重组效率高,简单温敏型质粒其他

生存压力pKC1139、pBV220操作简单,应用范围广CRISPR/Cas系统细菌、古细

菌Cas蛋白-编辑效率高,靶向性强,操作简单,脱靶效应

注：“-”表示无特定质粒

1基因敲除技术原理

1.1RecA系统同源重组法

RecA同源重组系统是大肠埃希菌中的内源性同源重组机制，组成它的蛋白质包括

RecA蛋白和RecBCD等[1]。RecA具有双重功能，它不但能改变单链的DNA分

子还可以激活蛋白酶，是大肠埃希菌recA基因座的产物，具有单、多聚体两种形

式，可以参与大肠埃希菌中任何同源重组机制。RecA蛋白是纤维状的，能够参与

DNA损伤的修复，总的来说，它有两个主要功能，一是能够促进DNA分子链之

间的交换，二是作为共蛋白酶可以促进阻遏蛋白LexA的自我水解，蛋白RecBCD

就是三种蛋白质RecB、RecC、RecD的复合体，这三种蛋白质可以解开DNA双

链，在Chi位点处形成DNA单链[2]。但是通过RecA系统难以成功获得基因缺

失突变株，其具有以下3个缺点：①重组的概率很低；②构建重组载体时需要的

同源臂较长；③RecBCD蛋白具有核酸外切酶的活性，可以降解线性的DNA片段

给替换载体的构建带来了困难。因此，由于RecA同源重组系统需要依赖于特定的

限制性内切酶酶切位点，并且需要的同源臂较长，具有操作复杂等缺点，现已很少

被使用[3]。

1.2Red系统同源重组法

Red重组系统来源于λ噬菌体，包括Exo、Beta、Gam3三种蛋白质，进行基因

敲除时将编码这三种蛋白质的基因克隆入载体，利用基因翻译成相应的蛋白质，使

得同源基因重组能够顺利进行。在这三种蛋白质中Exo蛋白具有λ核酸外切酶活

性，能够从DNA单链的5′端向3′