产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的.pdfVIP

山东农业科学２０２４ꎬ５６(１):１５６~１６３ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ

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ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ２０２４.０１.０２１

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产气荚膜梭菌α毒素基因数字ＰＣ方法的建立Ｒ

及其在标准物质研制方面的应用

１ꎬ２２２２３３２２２１

张铭洋ꎬ张喜悦ꎬ赵格ꎬ曲志娜ꎬ高宏伟ꎬ孙敏ꎬ程慧敏ꎬ徐佳微ꎬ王君玮ꎬ邹明

(１.青岛农业大学动物医学院ꎬ山东青岛２６６０００ꎻ２.中国动物卫生与流行病学中心ꎬ

山东青岛２６６０３２ꎻ３.青岛海关技术中心ꎬ山东青岛２６６０００)

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摘要:产气荚膜梭菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆ)ｒｉｎｇｅｎｓ是一种重要的人兽共患病原菌ꎬα毒素是其分子生物学检测

的主要靶标ꎮ试验选取Ｃｌｐ引ｅｒ物及探针建立微滴式数字ＰＣＲ(ｄｒｏｄｉｇｔｉａｌｐｌｅｔＰＣＲꎬｄｄ方法ＰＣꎬＲ最佳引)物浓

度０.８５μｍｏｌ/Ｌꎬ探针浓度为０.３μｍｏｌ/Ｌꎬ退火温度为６０℃ꎮ利用建立的ｄｄＰ方法检测ＣＲ单核细胞增生李斯

特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的ＤＮＡꎬ结果均为阴性ꎬ表明该方法具有较好

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的特异性ꎮ合成产气荚膜梭菌α毒素基因ꎬ制成ＤＮＡ标准品ꎬ选取３个稀释梯度的标准品进行重复试验ꎬ组

内和组间变异系数均小于５％证明该方法具有较好的ꎬ重复性ꎮ采用７个稀释梯度的标准品进行重复检测ꎬ

计算出该方法的检测限为１２.３９ｃｏｐ/μＬｉｅｓ定量限为ꎬ３３.９７ｃｏｐ/μＬｉｅｓꎮ通过对６８份临床样品进行检测ꎬ证实

该方法可用于临床ꎬ且用于检测质粒ＤＮＡ时无明显的基质效应ꎮ应用ｄｄＰ方法对ＣＲ标准品进行均匀性和稳

定性检验ꎬ并联合９家实验室进行定值ꎬ最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(ＧＢＷ(Ｅ)

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０９１２３７)ꎮα毒素基因ｄｄＰ方法的建立和ＣＲＤＮＡ标准物的研制ꎬ为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标

准化奠定了基础ꎮ

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关键词:产气荚膜梭菌ꎻｄｄＰＣ毒素Ｒꎻ基α因ꎻ标准物质ꎻ特异性ꎻ灵敏度ꎻ可重复性ꎻ定值

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中图分类号:Ｓ８５２.６１文献标识号:Ａ文章编号２０２４

ＤｅｖｅｌｏｏｐｍｅｎｔｆＤｉｇｉｔａｌＰＣＲｆｏｒα￣ＴｏｘｉｎＧｅｎｅｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆ

ａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｓ

ＺｈａｎｇＭｉｎｇｙａｎｇꎬＺｈａｎｇＸｉｙｕｅꎬＺｈａｏＧｅꎬＱｕＺｈｉｎａꎬＧａｏＨｏｎｇꎬｗＳｕｎｅｉＭｉｎꎬ

１ꎬ２２２２３３

ＣｈｅｎｇＨｕｉｍｉｎꎬＸｕＪｉａꎬｗＷａｎｇｅｉＪｕｎꎬｗＺｏｕｅｉＭｉｎｇ

２２２１

(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏＶｆｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖꎬｅｒｓｉｔｙＱｉｎｇｄａｏ２６６０００ꎬＣｈｉｎａꎻ

２.ＣｈｉｎａＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＥｐｉｄｅ