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药用蛇毒种属鉴别推荐方法
A-1.1药用蛇毒蛋白谱鉴别法A-1.1.1原理
尖吻蝮蛇药用蛇毒和白眉蝮蛇药用蛇毒蛋白谱存在显著差异。A-1.1.2鉴别方法
取尖吻蝮蛇药用蛇毒和白眉蝮蛇药用蛇毒冻干粉适量，加水溶解制成每1ml中1mg的样品溶液，照2020年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)通则0541第五法，非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定。分离胶浓度为12%，上样量每孔15μl，电泳结束后考马斯亮蓝染色，观察样品条带。
A-1.1.3结果判定
A-1.1.3.1在还原型电泳条件下，尖吻蝮蛇药用蛇毒相对丰度最高的3种蛋白分别是相对丰度35.7%的第10条带（分子量为11.9kDa），相对丰度24.9%的第8条带的（分子量为24.0kDa）和相对丰度19.7%的第3条带（分子量为62.9kDa）；
A-1.1.3.2白眉蝮蛇药用蛇毒相对丰度最高的3种蛋白分别是相对丰度27.0%的第3条带（分子量为68.0kDa），相对丰度20.7%的第9条带的（分子量为14.6kDa）和相对丰度
17%的第7条带的（分子量为26.8kDa）。
A-1.2聚合酶链反应法（PCR）A-1.2.1原理
根据药用蛇毒种属特异性基因，设计鉴别引物，通过PCR反应体系并验证样品浓度、检测灵敏度，比较供试品和对照药用蛇毒凝胶电泳图谱。
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A-1.2.2鉴别方法
A-1.2.2.1模板DNA提取
取本品适量，置乳钵中，充分研成至粉末，取0.1g，置1.5ml离心管中，加入消化液275μl[细胞液裂解液200μl]，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液50ul，蛋白酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液5μl]，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl（将DNA溶解出），混匀，加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟10000转）3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液800μl[5mol/L醋酸钾溶液26μl，1mol/LTris-盐酸溶液（pH7.5）18μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液（pH8.0）3μl、无水乙醇480μl，灭菌双蒸水273μl]，离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转入另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心（转速为每分钟10000转）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。
另取相应药用蛇毒对照品0.2g，同法制成对照DNA溶液。A-1.2.2.1PCR反应体系
在200μl离心管中进行，反应总体积为25μl，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（2.5mol/L）2μl，鉴别引物（10μmol/L）各0.5ul，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板0.5μl，无菌双蒸水18.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反复30次（95℃30秒，63℃45秒），延伸（72℃)5分钟。
A-1.2.2.3电泳检测
按照《中国药典》现行版四部琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），胶浓度为1%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药用蛇毒PCR反应溶液上的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为2μl（0.5μg/μl）。
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A-1.2.3结果判定
电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药用蛇毒凝胶电泳图谱相应的位置上，在相应位置应有单一DNA条带。
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