《生物药物分析与检验》第5章高效液相色谱法.pptx

高效液相色谱法;授课内容;一、起源和发展

1903年，俄罗斯科学家Tswett发现色谱分离

;1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。

60年代末期出现HPLC。

70年代HPLC-MS

2004年UPLC

;高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。;HPLC与经典LC区别;经典LC;高柱效——远高于一般LC

高灵敏度

高选择性

分析速度快

应用范围广泛（可分析80%有机化合物）;①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。

②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。

③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。

④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。;储液瓶;溶剂传输系统：心脏;1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2?m，可防止颗粒物进行泵内。

2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。

3.高压泵：

对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。;要求：

输出压力高；

平稳、脉冲小；

流量稳定可调；

耐腐蚀。;梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。

如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。

;在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。;通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。;分离和进样系统;2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重??性好，如图。;六通阀定量环;自动进样100样品盘/机器手/自动洗针;;内径：1～6mm，柱长：5～50cm；

柱填料粒径：5～10μm;柱性能指标包括在一定条件下（试样、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度H和理论塔板数n、对称因子f、容量因子k和选择性因子的重复性α或分离度R。

分析样品时，需检验柱性能是否合乎要求。;常用色谱柱柱效评价条件如下：

硅胶柱

样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；

流动相：无水己烷。

反相色谱柱

（ODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；

流动相：甲醇——水（85：15）

乙腈——水（60：4O）。

;正相色谱柱（氰基与氨基柱等）

样品：四氯乙烯（测死时间用）、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品；

流动相：正庚烷

;色谱柱柱效指标

填料粒径为3μm、4μm、5μm、7μm或10μm时，柱效应分别大于8万、6万、5万、4万及2．5万理论塔板数／米（或用m－1表示）。

;色谱柱的再生

反相色谱柱以甲醇一水（95：5）、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。

正相色谱柱（含硅胶柱）以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上。

;检测系统;仪器：检测器-紫外;（一）紫外检测器（UVD或UV）

HPLC分析中因此该类检测器应用很广。

原理：样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比。

检测系统：由光源、流通池、检测元件、微机及记录器等组成。

;优点：

灵敏度高，线形范围宽；

死体积小；

波长可选；

对流速和温度变化不敏感；

可用于梯度洗脱。;

常用纯溶剂的截止波长：水190、乙腈190、甲醇205、正己烷210、乙醚220、四氢呋喃225、二氯甲烷245、氯仿245nm。

;特点

①灵敏度高,噪音低，最小检出量可达10-12g

②不破坏样品，能与其它检测器串联。

③对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。

④属浓度型检测器。

弱点

①只能检测有紫外吸收的样品；

②流动相的选择有一定限制。;紫外吸收检测器的类型

分为：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器三种。

1.固定波