目的基因导入受体细胞及重组子的筛选.ppt

■酶切电泳筛选法通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来。■PCR检测法外源DNA的两侧序列多为已知序列，通过PCR扩增外源DNA，然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。3.核酸分子杂交检测法4.免疫化学检测法基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提第31页,共39页，星期六，2024年，5月条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。■放射性抗体检测法■免疫沉淀检测法■酶联免疫检测法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶合第二抗体，然后与目的蛋白抗原-抗体复合物结合，通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。5.转译筛选法转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。第32页,共39页，星期六，2024年，5月■杂交抑制转译要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA。原理：DNA蛋白质mRNA蛋白质×杂交转化菌落提取重组DNA与总mRNA杂交形成DNA-RNA杂种分子将总mRNA（包括DNA-RNA分子）提取出来体外转译蛋白电泳放射自显影总mRNA体外转译蛋白电泳放射自显影经对比，（1）比（2）中少了一种蛋白质找到一种转译作用被抑制了的mRNA筛选出重组菌落（或噬菌斑）步骤：（1）（2）（3）第33页,共39页，星期六，2024年，5月■杂交选择转译重组体库提取DNA固定在NC膜上与mRNA或总RNA杂交目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上将分离的mRNA进行体外转译凝胶电泳或生物活性检测找出单菌落重组体6.DNA-蛋白质相互作用筛选法原理：外源DNA蛋白质能与某一特定DNA序列结合作为探针与克隆群体杂交翻译第34页,共39页，星期六，2024年，5月克隆载体+外源DNA受体细胞导入转化子非转化子含有克隆载体或外源DNA不含有克隆载体或外源DNA重组子非重组子仅含有克隆载体含有克隆载体+外源DNA阳性克隆子含有外源目的DNA非阳性克隆子含有外源其他DNA图6.4转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞第35页,共39页，星期六，2024年，5月滤膜（固定抗体）+图6.5放射性抗体检测法第36页,共39页，星期六，2024年，5月图6.6放射性抗体检测法第37页,共39页，星期六，2024年，5月加入目的基因产物的标记抗体转化菌落不含有目的基因含有目的基因涂板培养抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素图6.7免疫沉淀检测法第38页,共39页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第39页,共39页，星期六，2024年，5月关于目的基因导入受体细胞及重组子的筛选第一节受体细胞受体细胞（receptorcell）：又称宿主细胞或寄主细胞（hostcell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。1.受体细胞的概念第2页,共39页，星期六，2024年，5月2.受体细胞选择所应遵循的原则便于重组DNA分子导入。能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。）便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的受体细胞基因型）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。第3页,共39页，星期六，2024年，5月受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。第4页,共39页，星期六，2024年，5月3.各种类型受体细胞的优缺点（1）原核细胞■优点大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因