《免疫学实验》小鼠脾脏单个核细胞分离-教学课件（非AI生成）.ppt

白细胞单个核单核(巨噬)淋巴组织单核BT多形核(PMN)嗜酸嗜碱嗜中*免疫细胞检测细胞数量检测淋巴细胞的采集和分离总数检测亚群检测*外周血单个核细胞的分离密度梯度离心法聚蔗糖—泛影葡胺Ficoll-Hypaque:1.077±0.001LC,M?:1.075—1.090RBC,粒细胞：1.092**T:表达CD2(SRBC受体）B:不表达CD2*******免疫细胞功能检测淋巴细胞转化试验细胞毒试验细胞因子检测溶血空斑实验*TPHA,ConA,PWM或Ag形态学观察Lc与淋巴母细胞的比值3H-TdR掺入法测cpm值***细胞因子检测细胞生物学方法:CK细胞敏感株免疫学方法：双抗夹心法分子生物学方法：RT-PCR,原位杂交，Northernblotting*待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37oC，16-20小时加入3HTdR（1-5?Ci）37oC，4-6小时收集细胞测定白细胞介素-2的测定示意图*特异性敏感性优点缺点细胞生物学方法低高可确定活性繁琐费时免疫学方法高较高易操作，可大量检测不能确定是否有活性分子生物学方法高高既可定量又可定位不能反映浓度和活性*小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法原理根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。因此，若用密度为1.088±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集单个核细胞。*密度梯度离心法聚蔗糖—泛影葡胺Ficoll-Hypaque:1.088±0.001LC,M?:1.088RBC,粒细胞：1.092**在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度（个/ml）。检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单个核细胞中着色的死细胞数*淋巴细胞浓度（个/ml）四个大方格细胞总数/4×10×2×103计算细胞活力（%）活细胞数/细胞总数×100%***思考题：用Ficoll-Hypaque分离液分离淋巴细胞的原理是什么？所分离得到的细胞都是淋巴细胞吗？***