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绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用

绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用

摘要：随着科学技术的不断更新和发展，绿色荧光蛋白在动物学、植物学、微生物学等领域的应用研究越来越广泛。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)可作为报告基因，且具有分子量较小、荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需要底物等的特点。本文就对荧光蛋白在分子生物学中的应用做一综述。

关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；应用

TheApplicationofGFPAsReporterGeneIntheMolecularBiologyAbstract:Withtheupgradeanddevelopmentofscienceandtechnology,theapplicationofgreenfluorescentproteinusedinZoology,Botanyandmicrobiologyismoreextensive.Asareportergene,GFPhavesomecharacteristics,suchaslowmolecularweight,goodfluorescentstability,non-toxicitytoorganisms.ThispaperreviewstheapplicationofGFPinthemolecularbiology.Keywords:greenfluorescentprotein,reportergene,applicationofGFP

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一类来自于海洋生物如水母、水螅和珊瑚等腔肠动物内的一种生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，能发射出绿色荧光。随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多管水母科和海紫罗兰科的GFP，即AequoriaGFP和RenillaGFP。本文根据近几年国内外的研究进展，综合介绍一下GFP作为报告基因的应用。

1关于GFP

1.1GFP的发现

1962年被下村修等人在太平洋多管水母中发现。1992年Prasher等详细描述了源于维多利亚水母绿色荧光蛋白的基因和蛋白质结构。1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞中克隆表达了绿色荧光蛋白。美籍华裔钱永健带领的研究小组培养出了许多GFP突变体。与野生型的GFP相比，这些突变体能更快的发射荧光，颜色更强，且有多种颜色

1.2GFP的作用机理

GFP编码238个氨基酸的多肽单体，相对分子质量为27kDa。GFP呈圆柱体结构，直径约为3nm，长约为4nm，外围是由11条片层链组成，内部含一个螺旋，两端由短的螺旋片段封闭，生色基团被保护于圆柱体内部。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团的部位。生色团的形成不受种属的限制。其通过分子内自催化环化所产生的对羟基苯哑甲基咪唑酮。它形成于蛋白序列中位于65—67位的残基。这3个氨基酸被强制构成一个急转弯的构型，Gly67的氨基就会对Ser65的羰基进行强亲核进攻。通过环化和脱水形成咪唑酮的结构，这时GFP还没有荧光性质。只有当氧分子存在时，残基66的折叠键脱氢，形成与咪唑酮相连的双键，才形成了具有荧光性质的GFP发色团。荧光生色团非常稳定，不易变性，用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。

2GFP作为报告基因在分子生物学中的应用

GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与。并且无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中,都能有效地监测基因转移。GFP作为一个新型报告基因其用途甚广，在生物学领域中发挥着重要作用，本文将从以下几方面进行阐述。

2.1GFP作为融合标签

利用DNA重组技术,将目的基因与GFP基因构成融合基因,转染合适的细胞进行表达,然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察，来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。此方法是GFP作为报告基因应用得最多也是最成功的。GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位。在多数情况下，GFP基因在N一或C一末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因。迄今为止,GFP已成功地靶入了大部分细胞器中,如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。

另外，除用于特定蛋白的标记定位外,GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

2.2GFP基因作为免疫标